呕吐毒素/玉米赤霉烯酮一体式时间分辨荧光免疫层析定量卡的制备及应用

张海涛，张居清，祁苏娴，朱亚俊，于 婷，杨婷婷,*

1.江苏省苏微微生物研究有限公司 (无锡 214063)2.盱眙金谷粮食集团有限公司 (盱眙 211700)

脱氧雪腐镰刀菌烯醇，又称呕吐毒素，是一种单端孢霉烯族化合物，由小麦赤霉病菌、禾谷镰刀菌复合群产生[1]。近些年研究发现呕吐毒素对人患有食管癌和IgA肾病有关，对人类及动物的健康构成威胁[2]。研究表明，呕吐毒素在人体内会存在一定量的沉积，但是无特殊的靶器官，细胞毒性极强。当人和畜牧食入被污染的粮食和饲料后，会引起呕吐、腹泻、厌食、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时会破坏造血系统甚至造成死亡。玉米赤霉烯酮，是一种镰刀菌属真菌分泌的类雌激素霉菌毒素，大量存在于玉米、小麦等农作物中，对动物肝脏等器官损伤较大，在体内沉积，会造成动物机能异常甚至死亡，给农牧场带来巨大的影响和经济损失[3-5]。

鉴于霉菌毒素对人类健康及粮食制品相关产业链的巨大危害，我国制定了严格的食品安全国家标准，GB 2761—2017对食品中霉菌毒素限量均做了明确的规定，其中明确规定谷物及其制品中DON的限量标准为1 000 μg/kg、谷物及其制品中ZEN的限量标准为60 μg/kg[6]。随着国人对食品安全重视程度意识的不断增强，监管部门对霉菌毒素的监测也愈发广泛。在监测工作中发现很多谷物容易同时受到多种霉菌毒素的污染，传统的单样品多毒素分指标检测方法极大的增加了检测的时间、人力和物力成本，如何实现多毒素一体式同步检测就显得尤为重要。

粮食安全关乎整个食品产业链的安全。基于小麦、玉米等原粮中同时受到呕吐毒素和玉米赤霉烯酮毒素污染比较普遍的客观现实，迫切需要建立一种更快速、更方便、更经济的快速筛查检测方法。鉴于此，本实验室在DON、ZEN单毒素检测试纸条的基础上，研制出呕吐毒素/玉米赤霉烯酮一体式时间分辨荧光免疫层析定量卡并进行了初步的推广应用。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

多通道时间分辨荧光免疫分析仪，SW-2型，江苏省苏微微生物研究有限公司；高速冷冻离心机，GL-21M型，湖南湘仪离心机仪器有限公司；低速垂直混合仪，HS-3型，宁波市新芝生物科技有限公司；数显超声清洗机，JM-07D，深圳洁盟清洗设备科技有限公司；精密鼓风干燥箱，BPG-9006型，上海一恒科学仪器有限公司；数显三维喷金划膜仪，HM3035型、精密数控裁条机，CTS300型、全自动裁条斩切机，ZQ2000型，上海金标生物科技有限公司。

玉米赤霉烯酮溶液标准物质，GBW(E)100301，国家粮食和物资储备局科学研究院；脱氧雪腐镰刀菌烯醇溶液标准物质 ，GBW(E)100304，国家粮食和物资储备局科学研究院； N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)、碳二亚胺(EDC)、牛血清白蛋白( BSA )， Sigma-Aldrich 公司； ZEN-BSA 偶联物、DON-BSA偶联物、抗ZEN单抗、抗DON单抗，江苏省苏微微生物研究有限公司制备；羊抗鼠IgG，上海杰一生物技术有限公司；硝酸纤维素膜CN140，德国赛多利斯；样品垫，SB08，上海金标生物科技有限公司；吸水纸，SX27，上海金标生物科技有限公司；PVC单面白色塑料胶板，SM31-25型，上海金标生物科技有限公司；小麦、玉米等原粮，实验室收集(经HPLC定值)。

1.2 实验方法

1.2.1抗DON单抗(或ZEN单抗)的荧光纳米微球标记[7]

准确移取100 μL经10 min后超声分散后的铕Eu3+纳米微球，加入到2 mL 带盖圆底离心管中，随即准确加入900 μL超纯水进行混合，将混合物超声分散5 min。另分别配制碳二亚胺(EDC)乙醇溶液和50 mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)乙醇溶液，准确移取配制好的EDC和NHS溶液各取50 μL加入上述超声分散后的混合物中，置于25 ℃条件下低速垂直混合仪上进行40min的旋转混合。将垂直混合后的离心管放入15 000 r/min的高速离心机内离心20 min，去除离心后混合物的上清液，然后准确加入1 mL超纯水进行5 min的超声活化。在超声活化后的微球混悬液中准确加入0.05 mg抗DON单抗(或抗ZEN单抗)，继续置于垂直混合仪上25 ℃条件下混合反应2 h，加入牛血清白蛋白使之最终浓度为0.5%，4 ℃封闭1 h，然后将封闭后的离心管放入15 000 r/min的高速离心机内离心20 min，去除离心后混合物的上清液，然后准确加入1 mL复溶液并超声分散5 min，置于2 ℃～8 ℃冰箱中冷藏备用。

1.2.2荧光免疫试纸条的组装

通过前期的实验条件筛选，确定最佳包被抗原、羊抗鼠IgG的工作浓度以及荧光抗体的工作浓度。用三维喷金划膜仪将 DON-BSA包被抗原(T1线)、ZEN-BSA包被抗原(T2线)和羊抗鼠IgG(C线)分别固相于NC膜上。将一定浓度的两种荧光标记抗体混匀后喷涂于结合垫上，上述NC膜和结合垫于45 ℃鼓风干燥箱中干燥24 h以上。以PVC单面白色塑料胶板为衬板，将制备好的样品垫、结合垫、固相后的NC膜与吸水垫，按顺序粘贴在PVC衬板上(见图1)形成试纸条大板，然后用全自动斩切机将整张大板切割成4 mm宽、60 mm长的个体按层析顺序固定于塑料卡内，用压壳机压紧卡壳，制备成DON/ZEN一体式时间分辨荧光免疫层析检测卡。将检测卡连同干燥机一并放入铝箔袋中在塑封机商进行热封，常温保存。

图1 时间分辨荧光免疫层析卡的组装示意图

1.2.3检测原理

呕吐毒素/玉米赤霉烯酮(DON/ZEN)一体式时间分辨荧光免疫层析检测卡基于抗原抗体免疫性竞争结合的原理，待测定样本中如果含有DON、ZEN等待测抗原，则在层析涌动过程中会与结合垫上荧光微球标记的特异性单克隆抗体反应，抑制带有荧光标记物的抗体与固相在NC膜检测线上DON-BSA与ZEN-BSA固相物的结合。待测物中DON与ZEN含量不尽相同，结合于检测线上的荧光标记的抗体量也不同，相应的检测线上微球的荧光强度也有强弱。使用多通道时间分辨荧光免疫分析仪对检测线进行扫描，仪器将光信号转换为电压信号，经过放大输入到模拟数字转换器，将模拟信号转换为数字信号，通过读数仪微处理器预置代码程序分别计算检测线T1、T2与C的荧光强度比值，结合标准定量曲线即可一体式同步定量测定样本中DON与ZEN的含量。

1.2.4标准曲线的建立

用体积比为50∶50的甲醇-水将DON与ZEN的标准溶液分别定容配制成1 000 ng/mL的标准储备溶液；配制4‰的Tween-PBS(0.01 moL/L，pH 7.2)采用梯度稀释的方法配制系列浓度为0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、25、50 ng/mL的DON/ZEN混标工作液。取各浓度混标工作液100 μL加至一体式检测卡的样品孔中，每个浓度做7平行，然后用多通道时间分辨荧光免疫分析仪读取T1、T2线荧光强度与C线荧光强度值，计算各浓度的T1/C与T2/C值。以系列标准工作溶液浓度为X值，各系列标准液的荧光强度T/C值与0 ng/mL标准液的荧光强度T/C值二者之间的比值为Y值，采用四参数Logistic拟合的方法分别绘制DON与ZEN的标准定量曲线。

1.2.5样品处理与测定

称取2 g粉碎后混合均匀的样品至离心管中，再用量筒取10 mL 60%甲醇-水至其中，混匀，密封；在漩涡振荡器上振荡3 min，移至高速离心机中4 000 r/min 离心 5 min，得上清液；用移液器吸取500 μL样品稀释液至离心管中，再定量吸取100 μL离心后样品上清液至其中，在漩涡振荡器上振荡30 s待用。提前将未使用的检测卡及配套试剂从冰室中取出平衡至室温，将检测卡平放，用移液器准确吸取100 μL 混合后的待测样液垂直加入样品孔中，开始计时；25 ℃反应 10 min 后，将检测卡放入多通道时间分辨荧光免疫分析仪中读数，仪器结合项目定量曲线预置信息计算检测结果。

1.2.6方法的技术参数

(1)灵敏度

(2) 检出限与定量限

(3)准确度

采用空白基质样品添加回收实验，在小麦和玉米样本中分别加入高、中、低这3个不同浓度的DON与ZEN标准溶液，按照1.2.5的步骤进行操作，采用时间分辨荧光检测仪读数得出检测浓度，按公式(1)进行计算。

(1)

(4)精密度

精密度依据批内精密度，指同一批次产品检测同一样本结果的重复性，用变异系数(CV)表示。分别选择低、中、高3种浓度的DON和ZEN标准溶液，采用不同批次的测试卡，重复10次试验，计算出同批次和不同批次批间的变异系数(CV)。

变异系数(CV)=标准差/检测均值/100%

(2)

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的建立

从图2、图3可以看出曲线横坐标采用的是浓度的自然对数，通过计算绘制得到的曲线是平滑的S型曲线，在0.5～50 ng/mL浓度范围内，DON的有效抑制率在78%～3%，线性回归相关系数为R2=0.990 1，直线方程y= -0.197 1x+ 0.623 4；在0.25～25 ng/mL浓度范围内，ZEN的有效抑制率在86%～14%，线性回归相关系数为，直线方程y= -0.187 2x+ 0.597 8。从而确定了DON和ZEN的标准曲线的线性范围，并以此作为以下实验的线性浓度。

图2 DON不同浓度(0.2～50 ng/mL)平滑曲线

图3 ZEN不同浓度(0.2～50 ng/mL)平滑曲线

2.2 灵敏度

在优化的测定条件下，对于DON，0浓度T/C的均值为3.006 2，标准差s为0.209 1，方法的灵敏度为0.42 ng/mL。而对于ZEN，0浓度T/C的均值为1.229 5，标准差s为0.071 6，方法的灵敏度为0.17 ng/mL。

2.3 定量限与检出限

对小麦、玉米的空白基质进行检测并计算后结果如表1，该方法中，DON的检出限为91.7 μg/kg，定量限为215.6 μg/kg，ZEN的检出限为10.05 μg/kg，定量限为20.13 μg/kg。

表1 DON及ZEN检出限及定量限

2.4 精密度

分别采用不同批次的荧光层析卡对低、中、高3种浓度的DON与ZEN标准溶液进行十次检测，批次内和批次间的CV值分别在4.93%～6.83% 和5.39%～9.25%(表2)，批内和批间CV均小于10%，说明该方法荧光层析卡均一性良好。

表2 荧光测试卡检测DON、ZEN的精密度试验(n=10)

2.5 准确度

根据国家限量标准以及本方法的线性范围，我们设定了3个浓度，涵盖了低、中、高浓度的加标回收测定。分别在阴性小麦和玉米中加入不同浓度水平的DON和ZEN标准溶液，DON加标浓度分别为500、1 000、2 000 μg/kg，ZEN加标浓度分别为30、60、120 μg/kg，TRFIA重复测定5次，DON的平均回收率在93.5%～106.5%，ZEN的平均回收率在88.9%～108.7%(见表3和表4)。

表3 小麦、玉米不同 DON浓度加标回收率

表4 小麦、玉米不同 ZEN浓度加标回收率

3 结论

本研究基于时间分辨荧光标记技术，应用免疫反应原理，开发出了DON-ZEN一体式时间分辨免疫荧光层析定量检测卡。结合现代光电转换技术及AI算法，在多通道时间分辨荧光免疫分析仪上，实现了一次取样、一次样本前处理、一次加样的一体式呕吐毒素和玉米赤霉烯酮毒素的同步检测。对所建立的方法进行了一系列参数优化，该方法的DON的检出限为91.7 μg/kg，定量限为215.6 μg/kg，ZEN的检出限为10.05 μg/kg，定量限为20.13 μg/kg。样品中DON的平均回收率在93.5%～106.5%，ZEN的平均回收率在88.9%～108.7%。

所建立的一体式时间分辨免疫荧光免疫层析定量卡操作简单，样品前处理只需要用甲醇简单振荡提取，经稀释后即可同时测定一个样本中两种毒素的含量，整个操作过程更快速、更方便、更经济，极大地满足了粮食收储及粮食制品加工企业的日常检测需求。