凯氏定氮法测大豆粉中蛋白质含量的不确定度评定

◎ 马晓倩，方 玲，袁月兰，赵成明

（马鞍山市产品质量监督检验所，安徽 马鞍山 243000）

目前蛋白质的检测方法主要有凯氏定氮法[1]、分光光度法和燃烧法，第一法和第二法适用于各种食品中蛋白质的测量，第三法适用于蛋白质含量在10 g/100 g以上的粮食、豆类奶粉、米粉、蛋白质粉等固体试样的测量。其中第一法凯氏定氮法测食品中的蛋白质是仲裁法，检测方法更加简单，检测结果更加准确可靠。针对不同食品，蛋白质含量有不同要求，当检测结果在限量值附近时，结果的准确性具有重要影响，不确定度[2]是检测检验结果的准确性的重要指标。本文采用《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5—2016）[3]中的第一法凯氏定氮法测量大豆粉中的蛋白质，根据蛋白质的计算方法建立数学模型。以《测量不确定度评定与表示》[4]（JJF 1059.1—2012）系统性地分析不确定来源，为样品检测结果提供可靠地科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆粉，市盐；酸标准滴定溶液，0.100 0 mol·L-1；氢氧化钠溶液，400 g·L-1；甲基红乙醇溶液，1 g·L-1；亚甲基蓝乙醇溶液，1 g·L-1；硼酸溶液，20 g·L-1；水为三级用水。

1.2 仪器与设备

Kjeltec 8400 凯氏定氮仪（瑞典，Foss）；Kjeltec 8400 八管消化炉（瑞典，Foss）；ME204E/02 梅特勒-托利多电子天平（分度值0.1 mg，瑞士Mettler TOLEDO公司）。

1.3 测量方法

称取充分混匀的固体试样0.5 g于消化管中，精确至0.001 g，再加入10 mL的硫酸溶液、0.4 g硫酸铜和6 g硫酸钾于消化炉中进行消化。当消化炉温度达到420 ℃之后，继续消化1 h，此时消化管中的液体呈绿色透明状，取出冷却至室温。设置仪器参数稀释液体积为70 mL，碱液体积为50 mL，接收液体积为30 mL，于全自动凯氏定氮仪[5]上实现全自动加液、蒸馏、滴定和记录滴定数据过程，实验前需做2次空白实验，再依次测量5次样品。

2 数学模型

根据蛋白质的计算原理，得出蛋白质含量计算公式如下：

式中：X-试样中蛋白质的含量，g/100 g；V-试液消耗盐酸标准滴定液的体积，mL；V0-试剂空白消耗盐酸标准滴定液的体积，mL；C-盐酸标准滴定溶液浓度，mol·L-1；0.014 0-1.0 mL盐酸标准滴定溶液相当的氮的质量，g；M-试样的质量，g；5.71-大豆粉中氮换算为蛋白质的系数；100-换算系数。

3 结果与分析

3.1 不确定度来源分析

凯氏定氮法测定大豆粉中蛋白质的含量的不确定度的来源主要是盐酸标准溶液的配制标定过程、氯化铵标准物质、分析仪器的重复测量过程以及样品前处理称量过程等环节。

3.2 盐酸标准溶液不确定度分量urel1

3.2.1 盐酸标准溶液的配制和标定

根据GB/T 601—2016[6]标准要求，先用浓盐酸配制成1 000 mL的0.1 mol·L-1的盐酸标准滴定溶液。重复滴定6次，计算得出盐酸标准溶液浓度分别为0.101 34 mol·L-1、0.101 51 mol·L-1、0.101 21 mol·L-1、0.101 32 mol·L-1、0.101 48 mol·L-1和 0.101 37 mol·L-1。盐酸标准溶液的平均浓度为0.101 4 mol·L-1。盐酸标准溶液滴定结果引入的标准偏差和相对标准不确定度分别为：

3.2.2 标定盐酸的基准试剂碳酸钠的纯度

按照GB/T 601—2016标准要求，将基准试剂无水碳酸钠于270～300 ℃的高温炉中烘干至恒重。基准试剂碳酸钠的纯度为100%±0.05%，视为矩形分布为：

3.2.3 天平称量所引入的标准不确定度

干燥器与天平[7]称量内均放置相同硅胶，称量时无吸潮。本次称量使用的天平是ME204E/02梅特勒-托利多电子天平，天平的量程为0～220 g，分度值为s=0.1 mg，根据该天平检定证书可知，在0～50 g称量范围内，天平的最大允许误差为0.000 5 g，采用矩形分布计算称样量为0.2 g时的标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

3.2.4 标定体积的不确定度

根据盐酸标准滴定溶液滴定的体积平均为37.25 mL，滴定使用50 mL酸式滴定管（A级），根据常用玻璃检定规程可知，50 mL的A级酸式滴定管的最大允许差为±0.05 mL，滴定体积平均为37.25 mL，按照矩形分布计算出标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

3.2.5 测量重复性带来的不确定度分量

测量重复性带来的不确定度分量ur5为0.001（主要包括人员、环境、测量方法和仪器重复性等其他分量带来的不确定度），则标准滴定溶液所引入的不确定度为：

3.3 氯化铵标准物质引入的不确定度分量urel2

本次校准实验使用的氯化铵标准物质编号为GBW06103，由国防科技工业应用化学一级计量站提供。根据标准证书得出其相对扩展不确定度urel=0.08%，k=2，则标准物质引入的不确定度分量为：

3.4 分析仪器的不确定度分量urel3

在同一条件下，使用凯氏定氮仪对消解的5组平行样品进行测定，结果如表1所示。

表1 大豆粉中蛋白质的测量结果表

根据试样分析结果，可计算出蛋白质的标准差s为：

其标准不确定度和相对标准不确定度分别为：

3.5 样品称量的标准不确定度分量urel4

根据该天平检定证书可知，在0～50 g称量范围内，天平的最大允许误差为0.000 5 g，采用矩形分布计算称样量为0.471 4 g时的标准不确定度为：

3.6 合成标准扩展不确定度评定

实验分析得到的不确定度分量之间互不相关，则使用凯氏定氮法测定大豆粉中的蛋白质的合成标准扩展不确定度为：

3.7 扩展不确定度评定及结果分析

假设测量过程中的误差属于正态分布，取包含因子k=2（置信区间为95%），则大豆粉中蛋白质的含量扩展不确定度为：U=k×uc=0.10×2=0.20。全自动凯氏定氮仪法测量大豆粉中蛋白质含量结果表示为X=（32.69±0.20）g/100 g，k=2（置信区间为95%）。

4 结语

本研究通过建立数学模型计算出蛋白质的含量，并从标准溶液、氯化铵标准物质、实验分析仪器以及样品称量等不确定因素分析大豆粉中蛋白质的不确定度，其中标准溶液和实验分析仪器是不确定度的主要影响因素。因此在实验过程中，应确保标准溶液配制的准确性和实验分析仪器的稳定性。当使用仪器时，应提前配制好实验试剂，在做大批量实验前，应对实验仪器回收率进行测量校准，确保实验仪器的回收率和稳定性满足实验要求，降低不确定度，提高实验检测结果的准确性。