β-葡聚糖作为包封剂对植物乳杆菌在模拟胃肠道和环境储存条件存活的影响

◎ 万 欣，卢宗梅，周 勇，陈 影，刘利利，叶 震，何 珣，陈可泉

（1.南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 211816；2.中粮生物科技股份有限公司，安徽 蚌埠 233000）

在过去的几十年里，益生菌在动物营养和人类健康领域的应用已展现优势，如替代化学合成抗生素、降低血清胆固醇、增强生物机体免疫功能、治疗肠道疾病等[1-3]。益生菌能够发挥益生功能的前提是它们必须在环境条件下有效储存和在胃肠道（GIT）条件存活下来。因此，为了使益生菌能有效保存和提高其在通过胃肠道过程时的生存能力，将益生菌封装到不易消化的食材中已被证明是非常重要且有效的。封装涉及将益生菌细胞固定在聚合物基质中，该基质能够在环境条件和胃中保留其结构，然后在肠道远端降解和溶解[4-5]。在目前被研究和使用的不同类型封装材料中，β-葡聚糖是一种独特的多糖，可以有效地被用作密封剂和热保护剂。β-葡聚糖的独特之处在于其固有的蜂窝状结构，这是其他多糖所没有的，这也使益生菌细胞容易被包裹在网络结构中。

β-葡聚糖是一种无支链多糖，由β-D-吡喃葡萄糖单元通过1,3-、1,4-和1,6-糖苷键连接[6-8]。β-葡聚糖具有益生元性质，能对动物和人类健康产生有益影响。β-葡聚糖作为益生元已被广泛研究。但是，到目前为止，还没有研究使用β-葡聚糖作为益生菌细胞的包封剂。考虑到这些因素，本研究旨在利用β-葡聚糖作为一种新型壁材料，用于封装益生菌细胞和评估其耐受热、低pH值和胃肠道压力的能力以及封装细胞在环境条件下的储存稳定性。

1 材料和方法

1.1 材料与设备

植物乳杆菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013，来源于中粮生物科技股份有限公司。研究中使用的所有化学品均为分析级。Lactobacillus plantarumCGMCC 15013在无菌MRS培养基（上海吉至生化科技有限公司，中国）中生长12 h。胰酶（Sigma-Aldrich公司，美国）。

JSM-5900扫描电子显微镜（JEOL公司，日本）。

1.2 封装

通过将3 g/100 mL β-葡聚糖和1 mLLactobacillus plantarumCGMCC 15013培养液充分混合来制备浆液；向该混合物中加入0.02 mL/100 mL吐温80；之后将混合物剧烈搅拌10 min直至其乳化并呈现乳脂状；然后向该混合物中加入33 mL PEG（聚乙二醇）并进行分离（30 min）；用含有5 mL/100 mL甘油的0.9 g/100 mL盐水洗涤，冷冻干燥并分别在4 ℃和25 ℃下储存。

1.3 扫描电子显微镜

将样品放置在附着于圆形铝制样品桩的胶带上。用金-钯垂直涂覆后，使用JSM-5900扫描电子显微镜在5 kV的加速器电位下对样品拍照。

1.4 封装率和储存稳定性

将1 g胶囊化微珠重新悬浮在9 mL磷酸盐缓冲液（0.1 mol·L-1，pH=7.0）中，然后均质化 15 min。菌落形成单位（CFU·g-1）通过将培养物稀释适当倍数后涂布在琼脂平板上，并在37 ℃条件下培养48 h来确定。使用方程（1）计算微囊化过程中的封装率（EY）（%）：

式中：N是微胶囊中的活细胞数（logCFU·g-1），N0是制备过程中添加的活细胞的初始数量（logCFU·g-1）。

为了确定封装益生菌细胞的储存稳定性，在4 ℃和和25 ℃下，每15天间隔计算活菌数，持续2个月。

1.5 在模拟胃液（SGJ）中存活

新鲜模拟胃液是通过将3 g·L-1胃蛋白酶悬浮在无菌生理盐水（9 g·L-1）中制备，并用 1.0 mol·L-1HCl将pH调节至3.0。将0.2 g胶囊化微珠（4 ℃储存）和游离细胞分别悬浮在10 mL模拟胃液中，并在37 ℃下以50 r·min-1的速度持续搅拌5 min、30 min、60 min和120 min。SGJ中的活菌计数确定为logCFU·g-1。

1.6 在模拟肠液（SIJ）中存活

取0.2 g胶囊化微珠和游离细胞，分别悬浮在模拟肠液中。肠液中含有1 mg·mL-1胰酶和7 mL新鲜鸡胆，用0.1 mol·L-1NaOH溶液将pH值调节至8.0。悬浮液在37 ℃下孵育6 h，SIJ中的活菌计数确定为logCFU·g-1。

1.7 游离和微囊化细胞在冷冻和热处理下的活菌数

将1 g微胶囊和1 mL游离细胞悬液转移到各含有10 mL无菌蒸馏水的试管中，并在不同温度（-75 ℃、55 ℃、65 ℃和75 ℃）处理样品1 min和10 min。

1.8 统计分析

使用商业统计软件包STATISTICA（StatSoft）计算平均值、标准偏差、方差分析（ANOVA）。然后在5%的显著性水平上使用Duncan的多重范围检验对这些数据进行比较。

2 结果和分析

2.1 扫描电子显微镜观察结果

扫描电子显微镜用于观察和研究干燥微胶囊的表面形态。β-葡聚糖具有粗糙表面和较大孔径的蜂窝。有文献报道了β-葡聚糖的分子结构为类似螺旋缠绕结构[9]，其致密、无裂纹的表面特征与内部蜂窝状结构一起，可使β-葡聚糖能够更好地承受机械应力并保护所含成分免受恶劣环境（例如氧化、光照、低或高pH值）的影响。含有Lactobacillus plantarumCGMCC 15013菌株的SEM照片显示，细菌细胞可以被包裹在β-葡聚糖中（图1b）。利用乳化法包囊在含有藻酸盐的植物乳杆菌CM53微胶囊中也报道了类似的分布模式[10]。

图1 β-葡聚糖封装Lactobacillus plantarum CGMCC 15013的SEM图

2.2 封装率和储存稳定性

封装的目的是保护封装的益生菌细胞免受有害环境条件的影响，例如热应激、胃肠应激和渗透应激等，并提高细胞在储存过程中的稳定性[11]。Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的初始活菌计数（logCFU·g-1）和封装率（%）分别为9.54和75.33%（p＞0.05）。乳化过程在室温下进行，有助于获得良好的封装率。使用乳化法进行封装时，与来自甜菜、菊苣和燕麦的β-葡聚糖的封装率相似[12]。在4 ℃和25 ℃下，间隔15天、持续2个月的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的生存能力显示在图2在4 ℃贮存60天后，包裹在β-葡聚糖中的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的存活量降至3.23 logCFU·g-1；而在25 ℃贮存60天后Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的存活量降至1.11 logCFU·g-1（图2）。

图2 封装Lactobacillus plantarum CGMCC 15013的储存稳定性图

然而，游离Lactobacillus plantarumCGMCC在4 ℃和25 ℃下储存60 天后的存活量都几乎可以忽略不计。结果表明，与游离Lactobacillus plantarumCGMCC 15013相比，封装Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的活力损失最小。储存后游离乳酸菌活力降低可能是由于环境压力造成的。然而，封装可以保护细胞免受这些不利环境条件的影响[13]。益生菌的特征之一是它作为配方产品应具有耐受储存期的能力。特殊类型的涂层材料用于增强微生物的这种特性，这是将益生菌封装在β-葡聚糖基质中的首次报告。β-葡聚糖已被报道为一种潜在的益生元，将益生菌掺入这样的包衣材料中，既可作为益生元又可作为包封材料，通过促进乳酸杆菌和双歧杆菌等有益微生物群落的生长，证明对胃肠道有益并在产品制造过程中保护益生菌[14]。

2.3 在模拟胃液（SGJ）中存活

将游离和封装的益生菌暴露于模拟胃液中，然后进行比较。如表1所示，与游离Lactobacillus plantarumCGMCC 15013相比，β-葡聚糖封装的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013在高酸性胃条件下能够显著保持活力（p＜0.05）。游离Lactobacillus plantarumCGMCC 15013 活 菌 数 为 9.54 logCFU·g-1， 但 在 暴 露于模拟胃液60 min后，游离Lactobacillus plantarumCGMCC 15013 的 存 活 量 降 低 至 1.01 logCFU·g-1；在暴露于模拟胃液120 min后没有观察到活菌。将包裹的细胞暴露于模拟胃液120 min后，发现Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的活细胞数为 1.23 logCFU·g-1。这些结果表明，β-葡聚糖在模拟胃液消化过程中为乳杆菌提供了有效保护，这可能是由于β-葡聚糖在低pH值范围内的稳定性以及人体胃肠道区域中不存在β-葡聚糖水解酶。

表1 β-葡聚糖包裹细胞在模拟胃液中的存活能力表

2.4 在模拟肠液（SIJ）中存活

模拟肠液对游离和微囊化Lactobacillus plantarumCGMCC 15013活力的影响见表2。结果显示，β-葡聚糖包裹的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013在模拟肠道条件下的存活数量明显高于游离Lactobacillus plantarumCGMCC 15013（p＜ 0.05）。暴露于模拟肠液6 h后，封装的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013活 菌 数 从9.54 logCFU·g-1降 低 至5.28 logCFU·g-1。暴露于胆盐溶液6 h后，游离Lactobacillus plantarumCGMCC 15013未观察到活菌。游离Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的存活数减少可能是由于细胞壁被破坏[15]。β-葡聚糖通过阻止被包裹的细胞与胆汁盐相互作用来提供对细胞壁破坏的抵抗力[7]。以低聚果糖（FOS）作为壁材的微囊化植物乳杆菌也观察到了类似的结果[4]。

表2 β-葡聚糖包裹细胞在模拟肠液中的存活能力表

2.5 冷冻和热处理下的存活

分别暴露于-75 ℃、55 ℃和75 ℃下10 min后，游离和微囊化Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的存活情况如表3所示。游离活细胞数和微囊化后活细胞数之间差异显著（p＜0.05）。游离Lactobacillus plantarumCGMCC 15013细胞对冷冻和热处理都非常敏感。在-75 ℃冷冻条件下，游离活细胞数量从9.54 logCFU·g-1减少到 5.11 logCFU·g-1；在 55 ℃下加热10 min后，游离活细胞数量减少至3.57 logCFU·g-1；75 ℃下加热10 min后，游离细胞无存活，这可能是因为细菌细胞的核酸和蛋白质等结构因加热变性，而最终导致细胞死亡[8]。

表3 β-葡聚糖包裹细胞在冷冻和高温处理下的存活能力表（活菌计数单位：logCFU·g-1）

封装的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013细胞在55 ℃下存活良好。与游离细胞相比，被包裹的细胞对热的敏感性较低。封装的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013活菌数仅从 9.54 logCFU·g-1减少至7.15 logCFU·g-1。

当温度从55 ℃增加到75 ℃，并在此温度条件下暴露10 min后，Lactobacillus plantarumCGMCC 15013活菌数为1.22 logCFU·g-1。β-葡聚糖可以作为微生物细胞抵御严酷外部条件的物理屏障，一定程度上增加被封装细胞的活力[6-8]。同为多糖材料的金合欢树胶已被证明可以在热应激期间为副干酪乳杆菌Lactobacillus paracaseiNFBC 338提供良好的保护作用。

3 结论

目前的工作已经证明了β-葡聚糖可以作为封装益生菌的潜在壁材，以提高的益生菌的生存能力。包裹在β-葡聚糖基质中的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013对冷冻、热处理、模拟胃肠道条件和储存的耐受性有所提高。通过SEM图片可以清楚地看出β-葡聚糖能够对Lactobacillus plantarumCGMCC 15013进行有效包裹。因此，β-葡聚糖封装益生菌可以提供一种功能性微生物菌剂长期保存的方法。