生活饮用水中菌落总数新方法应用探究

◎ 谢 俊，白 雪，高 然，赵永旺

（蒙牛乳业（宝鸡）有限公司，陕西 宝鸡 721013）

水中菌落总数是指水样在营养琼脂上，有氧条件下经过37 ℃培养48 h后，每毫升（每克）水样所含细菌菌落的总数。与生活饮用水有关的卫生问题大多来自于微生物污染，菌落总数作为生活引用水微生物检测的首选项目，在一定程度上标志着饮用水卫生质量优劣。目前国内常用检测方法是《生活饮用水标准检验方法 微生物指标》（GB/T 5750.12—2006）平板倾注法。

2008年菌落总数测试片法在食品领域广泛应用。本次选择3M PetrifilmTM菌落总数测试片法进行试验，其原理为采用可再生的水合物材质，由上下两层薄膜组成。上层聚丙烯薄膜含有黏合剂、指示剂及冷水可溶性凝胶；下层聚乙烯薄膜含有细菌生长所需的营养琼脂培养基。细菌在测试片上生长时，细胞代谢产物与上层的指示剂TTC发生氧化还原反应，将指示剂还原成红色非溶解性产物三苯甲臜，从而使细菌着色。故测试片上红色菌落判断为菌落总数。

3M PetrifilmTM菌落总数测试片法检测生活饮用水中菌落总数含量，对比国标法检测更便捷，且易于菌落辨别计数；为检测生活饮用水菌落总数找出一种便捷检测、且不影响结果准确性的新型方法，也为标准修订提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂

3M PetrifilmTM菌落总数测试片（货号70200572157，有效期至20220104）；营养琼脂（批次20190902，有效期3年，密封保存于阴凉干燥处）；3份质控样品（批次为QC-FD-034的生活饮用水中菌落总数定量分析质控样，由中国检验检疫科学研究院提供）；2份实验室间比对样（批次为20-C448和20-H712，由中国检验检疫科学研究院提供）。

1.1.2 仪器设备

电子天平（百分之一）、电热恒温培养箱、灭菌器、超净工作台、恒温水浴箱。

1.2 样液准备

1.2.1 质控样品

于无菌环境下开启冻干样品西林瓶盖，立即（1 min内）从220 mL无菌水中吸取20 mL加入西林瓶中将样品复溶，待样品粉末溶解后，将溶液吸出转移至无菌瓶中，再用余下的无菌水反复清洗西林瓶内壁，回收清洗液于上述无菌瓶中，220 mL溶液即为待测水样样品原液。

1.2.2 生活饮用水样品样液制备

依据《生活饮用水标准检验方法 微生物指标》（GB/T 5750.12—2006）进行处理。对1.2.1制备后的质控样品和生活饮用水样液以无菌操作方法吸取1 mL充分混匀的水样，注入盛有9 mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成1∶10的稀释液。吸取l∶10的稀释液l mL注入盛有9 mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成l∶100稀释液，并依次稀释成l∶l 000、l∶10 000稀释液等备用。每递增稀释一次，更换一支l mL灭菌吸管。

1.3 检测方法

1.3.1 营养琼脂平板倾注法

依据样品量及样本污染情况[1]，在无菌条件下用灭菌吸管取1 mL充分混匀的水样稀释液，置于2个无菌平皿内，同时吸取1 mL无菌生理盐水，做空白对照。倾注15～20 mL已融化并冷却至45 ℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。待冷却凝固后翻转平皿，置于（36±1）℃培养箱中培养48 h，进行菌落计数。

1.3.2 3M PetrifilmTM菌落总数测试片法

依据样品量及样本污染情况，在无菌条件下用灭菌吸管取1 mL充分混匀的水样稀释液[2]，注入3M PetrifilmTM菌落总数测试片中心位置，盖下膜后用压板压平，每次检验时进行平行接种，同时做空白对照。压板后至少等待1 min，置于（36±1）℃培养箱中培养（48±2）h，进行菌落计数。

1.4 统计方法

使用Mintable软件进行配对T检验分析，P＜0.05具有统计学意义。

1.5 计算方法

质控样品测试结果依据证书特性值区间进行评价；实验室间比对质控样品测试结果采用“稳健统计四分位距计算Z值”进行评价。当|Z|≤2，测试结果满意；当2＜|Z|＜3，测试结果有问题（可疑）；当|Z|≥3，测试结果不满意（离群）。

2 结果与分析

2.1 平板倾注法及3M PetrifilmTM测试片法检测结果及分析

选择15组自制水样、3组质控样、2组实验室间比对样分别使用营养琼脂平板倾注法和3M PetrifilmTM菌落总数测试片法进行检测，其检测结果使用精密度和T检验进行分析。由表1可知，两种方法检测结果的对数差绝对值均＜0.45，表明营养琼脂平板倾注法和3M PetrifilmTM菌落总数测试片法检测生活饮用水中菌落总数的差异符合要求。

表1 平板倾注法和3M PetrifilmTM测试片法数据对比分析表

由T检验得，平均差的95%置信区间为（-0.069 2，0.122 0），t=0.58，P=0.570＞0.05，表明营养琼脂平板倾注法和3M PetrifilmTM菌落总数测试片法检测生活饮用水中菌落总数结果无显著性差异，见表2。

表2 平板倾注法和3M Petrifilm TM测试片法T检验分析表

2.2 质控样品3M PetrifilmTM菌落总数测试片法检测结果及分析

由表3可知，质控样品使用3M PetrifilmTM菌落总数测试片法检测结果分别为4 000 CFU·mL-1，93CFU·mL-1、88 CFU·mL-1。对照质控样证书，检测结果均在证书特性值区间范围内，表明3M PetrifilmTM测试片法适用于生活饮用水中的菌落总数测定，检测结果精准。

表3 质控样品3MPetrifilmTM测试片法菌落总数结果评价表

2.3 实验室间比对样3M PetrifilmTM菌落总数测试片法检测结果及分析

由表4可知，实验室间比对样使用3M PetrifilmTM菌落总数测试片法检测结果分别为1 800 CFU·mL-1、370 CFU·mL-1，使用稳健统计四分位距法计算Z值分别为1.2、1.1，结果评价均为满意。表明3M PetrifilmTM测试片法适用于生活饮用水中菌落总数测定，检测结果精准。

表4 实验室间比对样3M PetrifilmTM测试片法菌落总数结果评价表

3 结论与讨论

（1）试验结果表明，3M PetrifilmTM菌落总数测试片法检测生活饮用水中的菌落总数结果与营养琼脂平板倾注法检测结果无显著性差异，从精密度、准确度维度进行评价，均表明3M PetrifilmTM菌落总数测试片适用于生活饮用水中的菌落总数测定。

（2）营养琼脂平板属于普通培养基，不具有选择性。出现特殊菌落、繁殖过快时易造成菌斑重叠覆盖现象，影响结果计数。而3M PetrifilmTM菌落总数测试片中含有指示剂TTC发生氧化还原反应使细菌着色，呈现红色斑点，便于计数。具体见图1、图2。

图1 平板法菌落形态图

图2 测试片法菌落形态图

（3）3M PetrifilmTM测试片法检测过程中减少药品称量、配置、灭菌、平皿清洗等环节，培养过程占用面积小，节省空间。适合培养空间小和检测样品数量多的实验机构。

综上所述，3M PetrifilmTM菌落总数测试片适用于生活饮用水中的菌落总数测定，同时为水质中菌落总数检测提供了一种便捷易操作的检测方法。