超声-微泡介导miR-128通过调节PTEN抑制乳腺癌细胞阿霉素耐药

翁沛华

广州市第一人民医院(广州 510180)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，化疗是各期病程的乳腺癌治疗的重要手段，乳腺癌的化疗药物也得到了不断的发展和补充。阿霉素是目前临床乳腺癌治疗中广泛应用的化疗药物之一。然而，约有70%的乳腺癌患者对其耐药或很快出现化疗耐药。miRNA通过与靶基因mRNA分子的3端非编码区(3’UTR)结合，抑制基因表达，参与调控生物生长和发育等过程。其中，miR-128被报道与许多肿瘤发生发展和耐药相关，然而其在乳腺癌阿霉素耐药中的作用和具体机制仍不明确。此外，多数靶向药物或小分子因为无法实现在肿瘤部位的靶向聚集并渗透到肿瘤内部，导致治疗乳腺癌效果不佳。超声-微泡携带药物或基因靶向治疗肿瘤是近年来超声分子影像学的研究领域的热点，在肿瘤早期的检测和疗效评价方面具有可观的应用前景。因此，探索超声-微泡介导miR-128在乳腺癌阿霉素中的作用和具体分子机制具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

胎牛血清和RPMI 1 640培养基购买自GLIBO公司，RNA提取试剂盒购买自AMBION公司，逆转录试剂盒和荧光定量PCR(quantitative PCR，qPCR)试剂SYBR Green购买自Roche，CCK8试剂盒购买自Roche，miR-128和β-actin的PCR引物购买自锐博生物。

1.2 细胞培养

人乳腺癌细胞MCF-7和阿霉素耐药细胞系MCF-7/ADM，用含10%胎牛血清的RPMI 1 640培养基并置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱内，取对数期、生长状态良好的细胞进行实验。

1.3 制备载miR-128阳离子脂质微泡

制备阳离子脂质微泡，每次实验前，通过阳离子微泡和miR-128孵育后进行DNA琼脂糖凝胶电泳的实验，测试出二者最佳孵育比例，每次处理细胞前，按每1 μg质粒与107～108个的微泡的比例共同孵育miR-128和阳离子脂质微泡30 min，得到载miR-128阳离子脂质微泡。

1.4 转染

将细胞以8 103个/孔浓度接种于96孔板，待培养密度约30%～50%汇合时进行siRNA转染。采用Oligofectamine Reagent转染试剂盒，选用miR-128过表达质粒进行转染，按试剂说明书操作。加入转染液培养4小时后，更换含有10%胎牛血清RPMI 1640培养液继续培养。

1.5 qPCR实验

利用TRIZOL法提取总RNA，根据Roche逆转录试剂盒对提取的RNA进行逆转录，使用3步法进行qPCR程序扩增，预变性95 ℃，3 min；变形95 ℃，3 s；退火56 ℃，34 s；延伸72 ℃，10 s，共40个循环，由2-△△Ct计算相对表达量。实验所需引物如下：miR-128,forward:5′-GCCGGCGCCCGAGCTCTGGCTC-3′；reverse：5′-TCACAGTGAACCGGTCTC-3′；β-actin，forward:5′-CTCGCCTTTGCCGATCC-3′；reverse：5′-GGATC TTCATGAGGTAG-TCA-3′。

基于SYBR荧光强度与双链DNA含量之间呈正相关的原理，实时荧光定量PCR可以通过检测荧光强度来计算基因表达。10 μL系统配置如下：

2 SYBR 5 μL

F+R 0.4 μL

cDNA 1 μL

DEPC 3.6 μL

总量 10 μL

注意：避免光照并在冰上操作。每个反应组需要设置3个侧孔，miRNA需要以U6作为内部参照，共同基因需要以β-actin作为内部参照。反应条件完成后，使用96孔板或八个连续的板来排列和添加样品，然后将它们放入Bio-Bad荧光定量PCR仪中，反应条件：5 ℃ 2 min，(95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)39 个循环。

1.6 CCK8实验

不同的细胞处理种植在96孔板上，根据实验设计加入阿霉素并培养，利用CCK8检测细胞活性并计算不同处理细胞阿霉素的药物IC50。主要实验步骤如下：

(1)在96孔板中接种不同处理的细胞(100 μL/孔)。将培养板先放在培养箱中一段时间(在37 ℃，5% CO2)；

(2)向每孔加入10 μL 的CCK8溶液(注意孔中不要有气泡生成)；

(3)将准备好的培养板放在培养箱内1～6小时；

(4)用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

1.7 统计学分析

实验数据以均数±标准差表示，采用SPSS 13.0软件进行分析，多组间两两比较采用完全随机设计资料的方差分析，分析前进行方差齐性检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-128在阿霉素耐药乳腺癌细胞中低表达

为研究miR-128在乳腺癌阿霉素耐药中的作用，我们前期构建了人乳腺癌细胞MCF-7和阿霉素耐药细胞系MCF-7/ADM，并通过qPCR检测了miR-128在亲代乳腺癌细胞MCF-7和阿霉素耐药的乳腺癌细胞MCF-7/ADM中的表达。实验结果显示，miR-128在阿霉素耐药乳腺癌细胞中低表达(图1)，且结果有统计学意义(P<0.05)。

图1 qPCR检测miR-128在阿霉素耐药乳腺癌细胞中低表达(P<0.05)

2.2 超声-微泡介导miR-128增强乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性

为验证miR-128在乳腺癌阿霉素耐药中的作用，我们在亲代人乳腺癌细胞中过表达miR-128，CCK8实验检测MCF-7过表达miR-128组和对照组阿霉素IC50的变化，以及检测超声-微泡miR-128组乳腺癌阿霉素IC50的变化。实验结果显示过表达miR-128能够增加乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性，超声-微泡介导的miR-128进一步增强了乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性(图2)，且结果差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 超声-微泡介导miR-128降低乳腺癌细胞阿霉素IC50(P<0.05，OE：过表达，UM：超声-微泡)

2.3 miR-128通过调节PTEN从而抑制乳腺癌细胞对阿霉素耐药

为研究miR-128调控乳腺癌细胞阿霉素敏感性的具体分子机制，我们在阿霉素耐药乳腺癌细胞中过表达miR-128后，qPCR检测PTEN的RNA表达水平。以及在阿霉素耐药乳腺癌细胞中过表达miR-128且过表达PTEN后，CCK8检测阿霉素IC50变化。实验结果显示，在阿霉素耐药乳腺癌细胞中过表达miR-128后，PTEN的RNA表达降低(图3)，且结果差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 qPCR检测过表达miR-128后PTEN的mRNA水平(P<0.05，OE：过表达)

且阿霉素耐药乳腺癌细胞中加入超声-微泡miR-128且过表达PTEN后，乳腺癌细胞对阿霉素恢复抗性(图4)，且结果差异有统计学意义(P<0.05)。

图4 CCK8检测超声-微泡miR-128且过表达PTEN卵巢癌阿霉素IC50(P<0.05，OE：过表达)

3 讨 论

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，化疗是治疗乳腺癌最重要的手段之一。但多达50%～70%的患者会出现显著的耐药，严重影响了患者的生存预后。因此，寻找安全有效的治疗方法治疗乳腺癌化疗耐药具有重要研究价值。基于这些原因，根据国内外的研究和前期的研究结果，我们提出超声-微泡介导miR-128通过调节PTEN抑制乳腺癌细胞阿霉素耐药的研究。在既往工作基础上，结合国内外研究重点，重点研究超声-微泡介导miR-128特异性靶向乳腺癌化疗耐药，有望为增强乳腺癌化疗耐药提供新的方法，为寻找和解决乳腺癌化疗耐药提供新的理论依据。我们通过qPCR检测miR-128在乳腺癌细胞系中的表达，并利用超声技术制备脂质微泡探究超声-微泡介导的miR-128对乳腺癌细胞阿霉素耐药的影响，CCK8实验检测乳腺癌细胞的活性；qPCR检测过表达miR-128后对PTEN的影响和对乳腺癌细胞阿霉素耐药的影响。miR-128在乳腺癌的发生发展过程中起重要作用,可以和RECK相互影响调控乳腺癌细胞的生物学行为,提示miR-128和RECK可能成为乳腺癌的潜在治疗靶标[3]。此外，miR-128被证明参与多种肿瘤化疗耐药，余晓玲的研究发现miR-128能够靶向Rap1B影响脑胶质瘤细胞增殖、侵袭及化疗敏感性[4]。在结直肠癌中，miR-128基因的超甲基化能导致NEK2的表达显著上调，可能通过对NEK2的调节改变肿瘤细胞的耐药型。陈云云研究发现miR-128与乳腺癌的紫杉醇耐药性有关，可以用于判断患者的紫杉醇耐药情况[6]。我们实验结果表明miR-128过表达可以增强乳腺癌对阿霉素的敏感性。进一步在乳腺癌中深入发现miR-128的作用，为揭示miR-128在乳腺癌中的作用提供了新的思路。载药超声-微泡的靶向治疗是当前医药领域中的研究热点。超声-微泡破坏技术介导的靶向药物和基因治疗是一种最新的靶向治疗方法。超声-微泡不仅可以作为一种超声造影剂增强成像对比度,更可以通过各种物理、化学修饰携带各种药物或基因在超声场强破坏作用下进行靶向治疗。近年来，应用微泡造影剂对乳腺癌进行靶向治疗成为超声分子影像学研究的重点领域，在早期肿瘤检测和治疗中具有良好的应用前景[7]。微小RNA(microRNA, miRNA)是由20～22个核苷酸组成的非编码区单链RNA，通过与靶mRNA的3′非翻译区相互作用，负向调控基因表达，抑制蛋白质的合成。前面我们已经证明miR-128介导了乳腺癌阿霉素耐药，因而利用靶向miR-128治疗乳腺癌阿霉素耐药成为了可能。然后，由于miRNA在体内易被降解，因此需要载体将其递送到靶组织，超声-微泡作为一种非侵入性和组织特异性的基因传递技术，安全性高、稳定性好、转染效率高，避免了基因在血液循环中的降解。Qin等[8]研究了超声-微泡介导的miR-205在前列腺癌发生发展中的作用，发现超声-微泡介导miR-205可有效抑制前列腺癌的发生发展。Yang等[9]利用超声-微泡将miR-let-7b转染到OCSCs中，结果表明超声-微泡联合miR-128为卵巢癌的基因治疗提供了良好的治疗策略。因此，利用超声-微泡载miR-128治疗乳腺癌阿霉素耐药被我们进一步研究。结果发现，超声-微泡介导的miR-128进一步增强了乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性，进一步探索超声-微泡介导miRNA特异性靶向乳腺癌增敏化疗疗效的研究，尽管超声联合微泡增敏化疗的相关研究目前尚未完全成熟，仍处于临床应用的早期，但其作为一种无创的辅助治疗手段，提高了肿瘤局部药物浓度，具有广泛的应用前景。今后随着研究的逐渐深入和各项技术不断优化，其将在临床中得到更广泛的应用,有望为乳腺癌治疗提供新的理论基础和实验方案。