河南省2019～2020年H3N2亚型流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因特征分析

僧明华,杨凯朝,王文慧,赵 升,徐 瑾

河南省疾病预防控制中心免疫预防医学重点实验室 郑州 450016

H3N2亚型流感病毒是河南省近年来的主要流行株，是流感防控的重点[1-2]。由于H3N2型流感病毒持续发生变异，自2012年以来，WHO更新了5次疫苗株，但抗原性分析结果显示疫苗匹配度较差[3]，疫苗保护效果欠佳[4-5]。H3N2亚型流感病毒的基因不断发生抗原性漂移，其蛋白构象的改变导致该种型别的流感病毒不易在鸡胚中培养，极少数能够在鸡胚中生长的病毒株又在抗原决定簇发生了数个鸡胚适应性突变，不能代表流行株的抗原特点[6]，因此H3N2型流感病毒疫苗株的选育成为难点。流感疫苗的生产主要通过经典重配技术和反向遗传技术来建立疫苗种子株，以提高疫苗株的安全性、产量和免疫原性[7-8]。因此需要加强对H3N2型流感病毒的基因特异性监测，分析每年度流行株的基因多态性，筛选出更优的疫苗推荐株，以提高疫苗的匹配度和保护效果，同时为疫苗种子株的研发奠定基础。作者对河南省2019～2020年H3N2亚型流感病毒的血凝素(hemagglutinin，HA)基因和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)基因进行特异性分析，以期发现关键性突变位点，为流感防控提供依据。

1 材料和方法

1.1 样本来源本研究所涉及的甲型 H3N2 亚型流感病毒毒株来源于2019～2020年监测年度河南省流感监测哨点医院流感样病例(influenza like illness，ILI)咽拭子的分离培养；病例定义、采样对象及标本采集方法参照《全国流感监测技术指南(2017 年版)》[9]。共采集ILI咽拭子标本16 340份，分离到H3N2亚型流感病毒557株，选取流行峰前、中、后共22株流感病毒株进行基因特异性分析。

1.2 样本采集、核酸检测及病毒分离咽拭子标本采集后于4 ℃保存，24 h内送至流感监测哨点医院所在地市的流感监测网络实验室。使用Ex-DNA/RNA病毒核酸提取试剂盒(CDC)(天隆科技，型号64T)提取病毒RNA，操作步骤参照说明书。使用甲型/乙型/甲型H1N1亚型/季节性H3亚型人类流感病毒四重实时荧光定量PCR检测试剂盒(卓诚惠生)进行流感病毒的核酸检测，操作步骤和阳性判断标准参照说明书。将0.5 mL H3N2流感病毒阳性标本接种于25 mL MDCK细胞培养瓶，置于35 ℃、体积分数5%CO2培养箱中吸附1～2 h。吸出接种物，清洗2遍，然后加入病毒生长液于细胞培养瓶中，置于35 ℃、体积分数5%CO2培养箱培养。每日观察细胞病变情况，当75%～100%细胞出现病变时进行收获，使用人“O”血球进行血凝试验和血凝抑制试验确认病毒株滴度和型别[9]，病毒培养物经离心收集上清液于-80 ℃保存备用。

1.3 序列测定所得病毒株送上海伯杰公司进行HA和NA基因测序。

1.4 基因序列分析采用MEGA7.0软件中的Clustal W方法对22株流感病毒株HA基因和NA基因的核苷酸和氨基酸序列进行同源性比对，基于最大似然法进行系统发育分析并构建进化树，Bootstrap法检验，重复值设置为1 000。分析序列所用的疫苗株为WHO推荐的流感疫苗株A/Kansas/14/2017、A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016等，其基因序列来自GISAID 公共序列库。采用NetNGlyc1.0 Server 在线分析软件(网址https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0)对病毒株的HA 和NA基因的N-糖基化位点进行预测。

2 结果

2.1 同源性特征22株病毒HA和NA基因核苷酸同源性分别为98.5%～100.0%、98.5%～100.0%；氨基酸同源性分别98.2%～100.0%、98.5%～100.0%，同源性较高。与2018～2019年的疫苗株相比，HA基因的核苷酸同源性在98.4%～98.7%，氨基酸同源性97.8%～98.4%；NA基因的核苷酸同源性98.6%～99.1%，氨基酸同源性97.8%～98.7%；与2019～2020年的疫苗株相比，HA基因的核苷酸同源性96.6%～96.8%，氨基酸同源性96.9%～97.5%；NA基因的核苷酸同源性98.1%～98.6%，氨基酸同源性97.4%～98.1%。

2.2 进化树分析见图1、2。22株流感病毒株的HA基因和NA基因在进化树上属于3C.2a1b分支，与2019～2020年北半球推荐疫苗株A/Kansas/14/2017的遗传距离较远，并不处在同一分支上。HA基因与3C.2a1b的3支代表株A/Jilin-Longshan/1235/2018、A/Macao/601326/2018、A/Kanagawa/IC1725/2018/2018[10]聚为一簇，而NA基因只与代表株A/Jilin-Longshan/1235/2018在同一簇，与A/Macao/601326/2018和A/Kanagawa/IC1725/2018/2018的距离稍远。在HA基因和NA基因的3c.2a1b分支内，该22株分成两个小分支，16株与A/Macao/600344/2020聚为一簇，6株与A/Beijing-Miyun/53/2020等聚为一簇。

●：H3N2型流感分离株；▲：历年疫苗株图2 2019～2020年河南省22株H3N2流感病毒NA基因遗传进化分析

2.3 分子特征分析与2019～2020年度疫苗株相比，所有分离株的HA基因共涉及32处氨基酸突变位点，涉及HA1蛋白的A(N137K，22/22)、B(K160S，22/22；N187K，22/22)、E(E78G，22/22)3个抗原决定簇，此外，S153F(16/22)位于HA蛋白的病毒特异性识别受体结合位点(receptor binding site，RBS)的口袋装结构底部，N137K(22/22)位于口袋装结构的前壁，R342K(22/22)突变位于HA蛋白的裂解位点(疫苗株为PERQTR)。其他共同突变位点有：N107S、S175Y、R342K、I422V、M494，主要突变位点有：K108R(20/22)、K176T(19/22)、S214P(13/22)。

NA基因的氨基酸位点变异共有21处，其中共同的突变位点共有8个：R75K、P126L、I140L、A149V、H155Y、K220N、V303I、T329S，主要突变位点4个：I257V(8/22)、V263I(6/22)、I302L(7/22)、I469T(15/22)，NA基因所有的氨基酸突变位点并非已报道的与耐药相关的关键性突变位点[11]。

2.4 糖基化位点分析对22株HA基因和NA基因进行潜在N-糖基化位点预测分析，结果显示，与当年疫苗株(A/Kansas/2017)HA基因的9个糖基化位点相比，22株分离株的糖基化位点发生149NGT缺失，18株新增174NYT糖基化位点(D区抗原决定簇)；与上年度疫苗株(A/Singapore/INFIMH/16-0019/2016)HA基因的11个糖基化位点相比，22株分离株的糖基化位点发生142NWT(A区抗原决定簇)、149NGT缺失，4株发生174NYT糖基化位点缺失。

与当年疫苗株NA基因的6个糖基化位点相比，未发生变异；与上年度疫苗株NA基因的7个糖基化位点相比，发生329NDS糖基化位点缺失。

3 讨论

HA与细胞表面特异性病毒受体的结合是导致病毒感染的先决条件。HA蛋白上的RBS呈口袋状，位于HA分子的球区末端，由底部、后壁、前壁、左侧壁、右侧壁构成，分别对应HA的数个氨基酸位点。大部分流感病毒HA的底部和后壁是保守的，不参与RBS位点与受体结合，可能起稳定RBS结构、促进病毒与受体结合和病毒繁殖等作用，而前壁和侧壁氨基酸位点的变异可能会影响到RBS与受体结合的稳定性[12]。本研究的22株毒株中，16株病毒发生RBS底部S153F的变异，22株病毒全部发生RBS前壁N137K的变异，推测其基因特性和抗原性发生改变，使之逃避了接种疫苗产生的宿主中和抗体的特异性免疫攻击，引起了2019～2020年河南省H3N2亚型流感的流行。此外，与受体结合密切相关的HA裂解位点一般只存在一个碱性氨基酸，若发生连续4个以上碱性氨基酸变异，病毒的致病力将会提高[13-14]。本研究的22株病毒发生了裂解位点内的氨基酸突变(R342K)，HA蛋白裂解位点氨基酸序列为PEKQTR(当年疫苗株为PERQTR),然而氨基酸K和R都是碱性氨基酸，且碱性氨基酸的个数也未发生变化，因此对病毒的致病力影响不大。

H3N2型流感病毒的HA基因序列分为7个组，其中3C组是最主要的分支，又分为3C.1、3C.2、3C.3三个亚组，在抗原性上相似[15]。3C.2组在2014年以来又分为3C.2a、3C.3a、3C.3b，在3C.2a、3C.3a 亚群中常发生抗原漂移。2018年以来，3C.2a成为主要流行分支，在分支内又分为3C.2a1、3C.2a1b、3C.2a2，每个分支有不同的代表株[16]。本研究所分析的22株河南省H3N2性流感病毒株，与2018～2019年北半球推荐疫苗株A/Singapore/INFIMH/16-0019/2016同源性较高，同属于3C.2a1分支，然而与2019～2020年北半球推荐疫苗株A/Kansas/14/2017相比，遗传距离较远，并不处在同一分支上。抗原性分析表明，2019～2020年H3N2亚型流行株与疫苗株匹配度仅为20.9%[2]，提示当年度疫苗预防效果欠佳。本文在做基因特征分析时，2020～2021年北半球推荐疫苗株(A/Hongkong/2671/2019)已经公布，因而在构建系统进化树时分析了此病毒株，结果显示与其同源性极高，推测2020～2021年度流感疫苗对H3N2型流感的预防效果较好。

抗原漂移是影响疫苗效果的关键性原因。一般认为，具有流行病学意义的流感病毒变种要存在一定的抗原差异，HA1 蛋白上至少有4个以上氨基酸发生替换，这些氨基酸替换需涉及2～3个抗原决定簇，上述氨基酸的替代可导致病毒抗原漂移[17]。糖基化位点的改变或增减会对病毒的抗原性和生物特性带来一定的影响，若糖基化位点变异发生在抗原决定簇，就会妨碍特异性抗体对病毒的识别，从而造成抗原漂移[18]。本研究所分析的22株河南分离株的HA基因涉及3个抗原决定簇的4个氨基酸位点变异，在1个抗原决定簇增加1个糖基化位点，可以推断，河南分离株与当年推荐疫苗株的基因特性有较大不同，出现了抗原漂移。

NA蛋白是流感特效药神经氨酸酶抑制剂类药物的靶向作用蛋白，2009年以来，不断有耐药株的报道出现，常见的与耐药相关的H3N2亚型流感病毒NA基因突变位点有E119V/I,R292K,N294S等[11]，这些位点的突变会导致病毒对神经氨酸酶抑制剂药物的敏感性降低。本研究分析的所有NA基因均未发生上述氨基酸位点的变异，提示河南株对神经氨酸酶抑制剂类药物敏感。

综上所述，2019～2020年河南省H3N2亚型流感病毒株的HA基因发生了明显的变异，与疫苗株的匹配度降低可能影响了疫苗的保护效果，从而造成持续的流行和暴发；NA基因未发生耐药性突变，神经氨酸酶抑制剂类药物依然是抗击流感的特效药。建议对H3N2型流感病毒进行持续深入的监测，尽快选育出与流行株更为相似的疫苗株，以提高疫苗的预防效果。