血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂对早期糖尿病肾病患者尿液中足细胞相关蛋白nephrin、自噬基因Beclin-1 mRNA排泄的影响

刘伦志, 邓 璐, 张明霞

(湖北民族大学附属民大医院 肾内科 湖北省肾脏病临床研究中心 风湿病发生与干预湖北省重点实验室, 湖北 恩施 445000)

根据中华医学会内分泌学分会在全国31个省进行的糖尿病的流行病学调查显示，我国18岁及以上人群糖尿病患病率约为11.2%[1]，其中约有20%～40%的糖尿病患者可能出现糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)[2]。DN已经成为慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)和终末期肾脏病(end stage renal disease, ESRD)最主要的的病因之一[3]。在西方国家，DN已成为ESRD的第一大病因[4]。根据中国肾脏病数据系统全国血液透析病例信息登记信息数据，2019年底我国血液透析患者约63万人，其中DN患者数居第二位，且近10年来发病率呈逐年上升的趋势，从2011年的15.1%上升至2019年的19.4%[5]。早期DN的诊治在慢性病的防治中有着重要的意义。足细胞损伤在DN的发生、发展过程中起关键的作用[6]，虽然肾穿刺活检已经广泛普及，但由于有创性，糖尿病患者对其接受程度不高，导致早期DN患者在病理水平的研究较为困难。在DN发展过程中，患者足细胞在高糖、氧化应激、自噬等损伤因素作用下其结构和功能均发生改变，部分足细胞锚链蛋白缺失、凋亡、脱落而随尿液排出体外。检测尿液中足细胞相关蛋白或基因就成为一个无创地了解足细胞损伤的措施[7]。本研究旨在探讨血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂(angiotensin Ⅱ type 1 receptor blockers, ARB)氯沙坦对早期DN患者尿液足细胞相关蛋白nephrin、自噬基因Beclin 1 mRNA排泄的影响，探讨足细胞的损伤机制及ARB的保护作用。

1 资料与方法

1.1病例选择 2018年1月-2021年1月于我院确诊资料完整的2型糖尿病患者48例为DN组。选取同期年龄匹配的健康志愿者30例为对照组。DN组男26例，女22例，对照组男16例，女14例，差异无统计学意义(P>0.05)。DN组39～79岁，平均(55.7±16.3)岁, 对照组34～71岁，平均(51.3±19.5)岁，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究通过医院伦理委员会论证批准。

1.1.1入选标准 符合早期DN诊断标准[8]，3～6个月重复尿白蛋白/肌酐比值(urine albumin creatinine ratio，UACR)为30～300 mg/g，肾功能测定内生肌酐清除率在60 ml/min以上，均用胰岛素控制血糖且达标。

1.1.2排除标准 ①有其他原发或者继发肾脏疾病，如急慢性肾炎，肾病综合征，IgA 肾病，过敏性紫癜肾炎，免疫性疾病肾损害，恶性肿瘤等疾病；②尿路感染；③内生肌酐清除率小于60 ml/min；④大量蛋白尿；⑤血糖控制不良；⑥正在或3个月内曾经服用血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin-converting-enzyme inhibitors, ACEI)或ARB类药物；⑦对氯沙坦及其辅料过敏。

1.2方法

1.2.1主要试剂及仪器 兔抗大鼠Podocalyxin多克隆抗体，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体(均购自Santa Cruz)，Trizol试剂盒(Invitrogen)，Rt-PCR试剂盒(Invitrogen)，nephrin及Beclin-1引物(天工生物合成)，倒置荧光显微镜成像系统(IX71，奥林巴斯)，实时荧光定量PCR仪(Roche Ligh-tCycler 480)。

1.2.2治疗 DN组给予氯沙坦50 mg/d (杭州默沙东制药)治疗，监测患者血压、肾功能、血电解质，如能耐受，逐渐加至100 mg/d。观察时间为6个月。

1.3观察指标

1.3.1尿液及生化指标 所有纳入观察的病例均常规查肝肾功能、血糖、血脂、血尿酸、血常规、糖化血红蛋白，检测尿液中微量白蛋白，24小时尿蛋白定量；收集晨尿100 ml， 30分钟内离心后免疫荧光检查尿液足细胞排泄个数，应用实时荧光定量PCR检测尿液中 nephrin，Beclin-1 mRNA 表达。

1.3.2尿液足细胞排泄个数 取新鲜晨尿100 ml，离心5 min(1 500 r/min)，取离心尿沉渣100 μl混匀，倒置显微镜仔细观察，如尿沉渣有单个核细胞者, 取沉渣50 μl置于自动涂片离心机、离心2 min(1 200 r/min), 加丙酮于4 ℃固定, 室温干燥。将涂片置于PBS浸泡湿润, 用1% BSA封闭，滴加兔抗Podocalyxin多克隆抗体，4 ℃孵育，对照滴加PBS，然后滴加FITC标记羊抗兔IgG二抗，37 ℃孵育30 min，加入碘化丙啶0.25 μg/ml于标本上复染细胞核, 室温下避光孵育5 min, PBS 漂洗, 50%甘油封片, 荧光显微镜580 nm波长观察，显微镜下类圆形绿色有核染者为足细胞。选取20个连续不重叠高倍显微镜下足细胞计数(个/20个视野)。

1.3.3尿液中nephrin、Beclin-1mRNA表达 收集新鲜晨尿100 ml，为尽量减少RNA酶的分解，于30分钟内迅速离心(1 500 r/min，5 min)，丢弃上清液，采用Trizol一步法提取总RNA，紫外分光光度计在260 nm和280 nm检测样品OD值，根据A260/280的比值来判断RNA样本纯度，如果其比值为1.8～2.0表示样本RNA合格。nephrin上游引物为5′-CGGAGAAGACTGAGGCGC-3′，下游引物为5′-TCACACCAGATGTCCCTCAG-3′，产物为459 bp；Beclin-1上游引物为5′-GGGGGTTGCGGTTTTTCTGGGA-3′，下游引物为5′-CTTGCCTTTCTCCACATCCTCCTG-3′，产物为95 bp。按照逆转录试剂盒说明逆转录合成cDNA，实时荧光定量PCR扩增，以βactin为内参照，每个样本重复3次取平均值。nephrin预实验确定的扩增条件为：预变性94 ℃ 5 min，变性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，循环30次，终延伸72 ℃ 10 min，最终反应体系为25 μl。Beclin-1预实验确定的扩增条件为：预变性95 ℃ 10 min，变性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 60 s，循环40次。采用2△△Ct法计算相对表达量，△Ct=Ct目的基因-Ct内参，△△Ct=△CtDN组-△Ct对照组。

2 结 果

2.1生化指标比较 对照组空腹血糖、胆固醇低于DN组(均P<0.01)，而DN组治疗前后空腹血糖、胆固醇比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。对照组与DN组、DN组治疗前后的血浆白蛋白和血肌酐比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1～2。

表1 两组生化指标比较

表2 DN组治疗前后生化指标变化

2.2UACR及足细胞排泄比较 DN组UACR与对照组比较显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)，给予氯沙坦治疗6个月后DN组UACR有一定程度下降，差异有统计学意义(P=0.033)；对照组尿液中很难检测到足细胞，而早期DN患者尿液足细胞排泄增加明显(P<0.01)。应用氯沙坦治疗6个月后， DN组足细胞排泄减少(P=0.038)。见表3～4。

表3 两组尿液足细胞排泄及UACR比较

2.3DN组尿液中nephrin、Beclin-1 mRNA排泄情况 对照组尿液中nephrin、Beclin-1 mRNA十分微量难以检出，DN组在应用氯沙坦治疗后尿液中nephrin、Beclin1 mRNA表达呈不同的变化趋势， nephrin mRNA表达较治疗前明显下调，差异有统计学意义(P=0.011)，尿液Beclin-1 mRNA排泄虽然总体呈上调趋势，但是差异无统计学意义(P=0.067)，见表5。

表4 DN组治疗前后尿液足细胞排泄及UACR比较

表5 DN组治疗前后尿nephrin、Beclin-1 mRNA排泄

3 讨 论

DN是严重危害身体健康及导致ESRD的重要疾病之一。全球目前有约3亿糖尿病患者，其中约25%～40%发展为DN[9]，我国糖尿病流行病学调查结果与其基本一致。在DN的发病机制中，足细胞损伤的作用越来越受到重视，足细胞受损是DN发展的关键[10]。足细胞足突融合、裂孔隔膜损伤、足细胞过度凋亡、足细胞密度下降与DN的蛋白尿、肾小球硬化密切相关。因此，有学者认为DN的本质就是足细胞病[11]。

DN患者足细胞凋亡、锚链蛋白丢失，足细胞从基底膜上脱落。一方面基底膜裸露刺激纤维蛋白增生，导致肾小球不可逆硬化，另一方面脱落的足细胞可能出现在尿液中，同时其携带的足细胞相关蛋白也会出现在尿液中[12-13]。研究发现，肾素血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)的激活可导致足细胞损伤，抑制RAS激活对足细胞具有保护作用，可以延缓DN的进展[14-15]。但是，这些研究多是动物实验或者体外研究，对于糖尿病患者的直接研究证据较少。在本研究中也发现正常健康人足细胞排泄很少，难以被检测到，早期DN患者尿液中足细胞排泄明显增加，尿液中足细胞相关蛋白nephrin mRNA也同步增加，间接验证了足细胞受损脱落。而应用氯沙坦后患者足细胞及足细胞相关蛋白nephrin mRNA排泄减少，提示ARB能减少足细胞的脱落，对糖尿病患者足细胞具有保护作用。

自噬在糖尿病足细胞损伤过程中有着重要地位[16]。在RAS激活导致的足细胞损伤过程中自噬也扮演着重要角色[17]。自噬是细胞通过一系列复杂机制降解自身受损的细胞器，是细胞自我更新的一种程序性死亡，以维持细胞的自身稳态。正常情况下，足细胞由于代谢的活跃及所处的特殊地位容易受到损伤，其基础自噬相当活跃，其代表自噬活性的LC3、Beclin-1通常表达丰富[18]。由于糖尿病患者细胞能量过度，足细胞会下调自噬水平，同时由于DN患者足细胞暴露的损伤及应激因素显著增加，对自噬的保护性需求增加，这种自噬水平下降和需求增加之间的矛盾会导致细胞老化、细胞损伤、功能障碍，最终加速DN的病理生理过程[19]。本研究也发现尿液中代表自噬活性的Beclin-1 mRNA水平在正常人难以检测出，可能与健康人足细胞随尿液脱落排出很少有关，早期DN患者尿液中Beclin-1 mRNA呈低水平表达，应用氯沙坦后虽然尿液中检出的足细胞排泄减少，但尿液中Beclin-1 mRNA水平反而升高，说明单个足细胞中Beclin-1 mRNA表达水平是有所提高的，提示ARB可能通过提高DN患者足细胞自噬水平达到保护作用。

综上，对早期DN患者及时应用ARB，减少尿微量白蛋白排泄，保护足细胞，并可能增强足细胞自噬作用，使之收益。