关于采用计时酵母菌解决面团发酵问题的研究

史珩 严无忌 何佳茜 李政熙 梅一丁

（北京第四中学，北京 100009）

面包是一种将面粉加水和其他辅助原料等调匀、发酵后烤制而成的食品。近年来，因其品种、口味日益丰富，面包作为主食或茶点越来越流行，也有越来越多的人在家自制面包。疫情的蔓延和持续进一步激发了人们居家烘焙的热情。国外调查表明，英国在2020 年5 月前短短12 周里，人们在家庭烘焙中的投入增长了49%，很多烘焙原料出现了供不应求的现象[1]。在中国，面包店数量快速增长，与此同时，人们自己烘焙面包也成为时尚选择。

然而，面包制作工序较为复杂，最关键的环节是面团的醒发，即面团发酵。面团的发酵是一个复杂的生化反应过程，不仅要控制发酵时的湿度、温度，更要掌控发酵的时间，而家庭烘焙者因为不够专业、缺乏经验，不容易精确控制发酵时间，或者忘记时间而没有及时让面团停止发酵，从而发酵过度，这些都会对面包的保鲜期、口感、柔软度和形状等产生很大影响。而具备规模的连锁面包房聘请的专业面包师，多使用冷冻面团制作面包。冷冻面团采取极速冷冻的方式使酵母菌休眠，以暂停发酵。但是该过程会破坏面筋的组织结构。此外，冷冻面团运送到面包房，需要解冻后进行二次发酵，在解冻的过程中，酵母菌会恢复活力并发酵，面包师无法准确估量其发酵程度，从而导致解冻后二次发酵控制难度增加，极易发酵过度。

本研究小组利用基因编辑技术研发出一种新型的计时酵母菌，通过基因控制酵母菌的休眠和唤醒，将其应用至面团发酵过程，可大大提高面团发酵的成功率，若最终投入商用，将对面包行业的发展带来一定的影响。

一、面团发酵

（一）面团发酵原理简介

面团发酵是一个厌氧过程。其原理是：Saccharomyces cerevisiae酵母、野生酵母和乳酸菌[lactic acid bacteria（LAB）]这三种微生物，将面粉中的淀粉、多糖等运用淀粉酶使其分解为单糖后，再通过呼吸作用，将单糖转化为二氧化碳、酒精、乳酸等物质[2]。

（二）面团发酵过度的原因分析及研究思路

影响面团发酵的因素很多，例如温度、湿度、面团含糖量、含盐量等，但用来控制发酵程度的途径主要为时间。

面团经过一定时间的适度发酵，其产生的二氧化碳可以支持面筋蛋白，使面包具有一定的结构而不塌陷，适度的乳酸也使得面包具有了独特的风味。但是当发酵时间过长，面团过度发酵产生的过量二氧化碳，会破坏面筋结构，导致面包塌陷，过量的酒精及乳酸也会影响面包的口感和风味。

基于此，研究小组针对发酵时间的控制提出思路：研发一种计时酵母菌，在一定时间后酵母菌自动死亡，从而发酵过程终止。

二、基因编辑技术

（一）基因编辑技术原理简介

基因编辑（gene editing），又称基因组编辑（genome editing）或基因组工程（genome engineering），是一种新兴的、能比较精确地对生物体基因组特定目标基因进行修饰的基因工程技术。

早期的基因工程技术只能将外源或内源遗传物质随机插入宿主基因组，基因编辑则能定点编辑想要编辑的基因。

基因编辑依赖于经基因工程改造的核酸酶来对目的基因进行编辑和定向改造，该核酸酶也称“分子剪刀”，其DNA 结合结构域可以识别、结合靶DNA 的特定位点，对DNA 进行切割、修饰等操作。

基因编辑以其能够高效率地进行定点基因组编辑，在基因研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力。[3]

（二）对酵母进行基因编辑

在基因编辑出现100 多年后，人们发现了理想的可以基因编辑的对象——Saccharomyces cerevisiae，它不仅具备容易操作且安全的优点，还是运用在基因编辑中的首个酵母。该酵母具有高效率的同源重组机制，也是第一个具有完整基因序列的真核生物。目前，酵母已经成为一个用于生产抗生素或疫苗等众多产品的平台，被誉为“21 世纪生物的实验对象”。

三、计时酵母菌基因设计

（一）初步设计

研究小组没有对酵母菌自身进行编辑，而是在体外将目的基因构建重组质粒（图1 左上），将其导入大肠杆菌寄主细胞（图1 右上）后组成转化细胞（图1 中下），导入酵母菌体内。

最初的设想是设计一个以toggle switch（拨动开关）为原理的通路。如图2，Toggle switch 由两个互相抑制的启动子蛋白组成——lac 蛋白（P lac）和lambda 蛋白（Pλ）。启动子的构建方式是把原核生物启动子添加到真核生物启动子TATA 序列的下游。相关研究表明这种方法可以构建高效的真核启动子[3]。

在酵母菌被激活后，cI 蛋白抑制蛋白和毒素蛋白的表达。在开关外，一个半乳糖启动子控制另一个lacI（lac inducer，lac 蛋白的诱导子）基因的表达。在系统加入半乳糖被后，lacI 得以表达，诱导拨动开关转到另一种状态。在这种状态下，毒素蛋白开始表达和积累。

经实验发现，可以通过调整拨动开关中的启动子强度，生产具有不同发酵时间的计时酵母菌。

（二）初步设计的不足与改进

首先，初步设计没有充分考虑基因工程带来的食品安全问题。虽然上述通路设计过程产生的毒素对人体无害，但是公众仍会本能地对毒素产生排斥反应。

其次，该设计需要连续的lacI 蛋白积累，如果用半乳糖启动子来实现这个功能，半乳糖的量将很难控制。半乳糖太少，则半乳糖很快会被耗尽；太多则会影响面包的口感和风味。

为改进实验设计，研究小组采用营养缺陷型酵母菌代替毒素蛋白部分，以达到相同目的，并且在通路里加入整合酶，使lacI 可以在半乳糖的单次刺激后持续积累。整合酶是来自病毒的酶，可以使病毒的DNA 整合到其寄主的特定识别位点。如果把噬菌体和细菌的结合位点放在DNA 序列的两端，整合酶会识别这些位点，并翻转二者中间的序列[6]。

改进后的设计如下：

1.最初状态

实验开始时，拨动开关处于“关”的状态，营养素的互补基因得以表达，使酵母获得营养，可以正常工作。

2.通路的起始与激活

在加入半乳糖（烘焙原料之一）后，半乳糖会激活pGAL 启动子，起始整合酶的表达，如图3。整合酶的表达使启动子与lacI 基因排成一条直线，翻转lacI 上游的启动子序列，lacI 开始表达和积累，如图4。

lacI 拨动开关打开，抑制拨动开关的另一部分——CI 序列（如图5）的表达，导致CI 浓度下降。

该设计通路，可以让拨动开关的两个产物的浓度维持在一个相对稳定的水平，在半乳糖被移除的情况下其功能也不受影响。

3.发酵终止

当lacI 过度表达时，与之互补的CI 基因的表达停止，CI 浓度大幅下降，下游基因营养物（亮氨酸）的表达也随之终止，浓度大幅下降，酵母因为缺少必需营养素而进入休眠状态，发酵暂停（如果不需要二次发酵，也可以就此停止发酵）。

（三）计时酵母菌的时间控制研究

不同种类面包所需发酵时间不同，因此需要不同强度的启动子。为此，基于前辈研究的基因表达生化反应速率公式[7][8][9][10][11]，研究小组推出了如下新的建模公式：

公式（1）和公式（2）中，μ 是抑制蛋白1 号的浓度；v 是抑制蛋白2 号的浓度；α1 是抑制蛋白1 号的有效合成率，α2 是抑制蛋白2 号的有效合成率；γ 是对启动子1 号的抑制的协同性，β 是对启动子2 号的抑制的协同性。

建模后，研究小组先用一至两对启动子进行测试，根据实验测得的有效合成率和协同性，对参数进行赋值，并拟合出关于启动子强度与发酵时间关系的图像，以便对模型进行调整，如图6。其中，假设的参数为α1=4；α2=4；β=2；γ=2：。

在经调整找到最佳公式（模型）后，可以不必每一次都做实验，而是通过计算，直接找出针对特定发酵时间的合适的启动子强度，从而生产出不同控制时间的计时酵母菌。

四、结语

（一）计时酵母菌的应用前景

计时酵母菌目前的主要目标客户是家庭烘焙者和冷冻面团生产商。

针对计时酵母菌的原理、特征和优势，研究小组已经在几所学校做了公众宣讲，并在社交媒体上对此进行了广泛宣传，收集了公众对于这个研究成果的看法。很多人对该项目表示期待，计时酵母菌的应用将对他们很有帮助。但是，仍有不少受访者对基因编辑产品抱有排斥与戒备的心理，这主要是因为他们对基因编辑没有充分的了解，而近年来关于转基因食品安全问题的争论未能有效消除人们的顾虑，甚至由于缺乏公共说理，加剧了人们对基因技术及应用态度的撕裂，部分人仍是“谈基因色变”。业内人士则持相对理性的态度，其中，中国农业大学梁建芬教授认为“研究并推广基因编辑的计时酵母菌有创意和可实施性，不过公众对于基因编辑产品，尤其是与食物相关的，有一定抵触心理，这是基因研究工作者需要关注的”。面包坊从业者表示看好产品的前景，目前最重要的是产品的成熟度和稳定性。

研究小组认为，随着基因技术进一步发展，基因编辑及分子生物学相关知识的普及化，并且在基因产品经受了一定时间的检验后，人们对计时酵母菌运用于面包生产的抵触心理也会逐渐消失。

下一步，研究小组还将通过多次实验，以确保通路设计的可靠性。在实验成功后，会将计时酵母菌参与生产的面包提交政府相关部门审核，在政府批准后，再通过市场调研和可行性研究评估，进一步考虑商用，投入生产。

（二）未来展望

研究小组现有的设计主要针对一次发酵的面包，对于需要二次发酵的情况，如何让酵母在走出休眠状态之后重启计时系统，仍需进一步研究和探索。

此外，在应用阶段，研究小组计划寻找降低生产成本的方案，尽可能让价格接受度更高，更有利于商业推广。