基于关联规则和网络药理学探讨膝骨关节炎内服方剂的用药规律

王 彬，武亭宇，吴 剑，王博龙

宜春学院化学与生物工程学院(江西 宜春 336000)

膝骨关节炎(Keen Osteoarthritis，KOA)是临床常见的膝关节慢性退行性病变，主要临床表现为关节肿胀、变形和疼痛、肢体活动受限，随着病情进展，严重者可致残致畸[1]。因经济负担及术后并发症的影响，西医治疗KOA主要采用非甾体类抗炎药物、糖皮质激素类药、生物制剂等保守治疗，虽可暂缓患者临床症状，但难以恢复关节功能[2]。中医学将KOA归属于痹证、筋痹、骨痹等范畴[3]。肝主筋，肾主骨，肝肾亏虚，寒湿之邪乘虚内侵，气血运行不畅，筋脉不得濡养，故不荣则痛[4-5]。因此，KOA证属本虚标实，肝肾亏虚筋骨失养是其内因，气滞血瘀风寒湿邪痹阻经络为其外因。本文基于关联规则挖掘KOA内服方剂的用药规律及核心药物，并运用网络药理学方法解析核心药物的作用机制，为临床用药提供参考。

1 资料与方法

1.1数据来源与筛选从知网、万方、维普等数据库收集治疗KOA的内服方剂，要求处方完整、剂量准确、疗效确切，检索期从建库起至今。剔除动物实验、中成药、中药提取物、中药贴剂，注射剂治疗等文献。

1.2数据录入参考2020版《中华人民共和国药典》[6]统一方剂中的中药名称，如“生地”统一为“生地黄”。采用双人双录入的方法将所收集方剂的中药录入Microsoft Excel 2010表格中，并由双人进行数源审查、核对，确保数据准确无误。

1.3数据分析根据2020版《中国药典》判定每味中药的性味、归经及功效。应用IBM SPSS Statistics 20进行用药频次、性味、归经分析以及聚类分析。应用Clementine 12.0的关联规则分析挖掘核心药物。

使用TCMSP数据库(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php)筛选核心药物成分及靶点，将成分靶点与在GeneCards数据库(https：//www.genecards.org/)获得的KOA靶点找重，得到核心药物治疗KOA炎的靶点。采用DAVID数据库(https：//david.ncifcrf.gov/)进行KEGG通路富集分析，最后通过Cytoscape 3.7.2软件构建成分-靶点-通路关联网络图。

2 结果

2.1性味归经统计统计KOA内服方剂所用127味中药的性味归经，结果如图1所示，四气以温性最多，使用频次为225次，其次为平性，使用频次为129次；五味以甘味最多，使用频次为233次，其次为辛味和苦味，使用频次分别为214次和208次。归经以肝经最多，使用频次为230次，其次为肾经和脾经，使用频次分别为201次和197次。

图1 药物性味归经雷达图

2.2用药频次统计频次统计显示，50首方剂的127味中药累计使用460次，其中使用频次≥10的高频中药由高到低分别为牛膝、甘草、川芎、当归、独活、杜仲、白芍、秦艽等14味，见表1。

表1 KOA中药频数分析

2.3关联规则分析使用Clementine 12.0软件对高频中药进行关联规则分析，根据Apriori算法设定支持度为10%，置信度为60%，二联对药的最大前项数为1，按照置信度高低进行降序排列，三联角药最大前项数为2，按照支持度高低进行降序排列。由表2可见主要药对20个，其中支持度最大的为川芎-牛膝、当归-牛膝、川芎-当归(38%)。由表3可见主要角药10个，其中支持度最大的为川芎、牛膝-当归(32%)。利用Clementine 12.0构建治疗KOA高频中药的网络关联图。如图2所示，每味中药物所连接线条越多代表其关联规则越多，所连线条越粗代表该关联规则越强。结果发现关联性多且高的中药有牛膝、独活、甘草、杜仲、当归、川芎、白芍、茯苓、细辛。

表2 治疗KOA中药二联规则分析

表3 治疗KOA中药三联规则分析

图2 治疗KOA中药的网络关联图

2.4聚类分析利用IBM SPSS Statistics 20进行聚类分析，如图3所示，治疗KOA中药按功效可分为4类。第1类：川芎、细辛、当归、杜仲、桑寄生、牛膝、独活。第2类：甘草、白芍、黄芪。第3类：茯苓、白术、熟地黄。第4类：薏苡仁。

图3 治疗KOA中药聚类分析的树状图

2.5核心中药成分-靶点-通路网络由关联规则分析可知，川芎-牛膝、当归-牛膝、川芎-当归3个药对的支持度(38%)最高；而角药中川芎、牛膝-当归角药的支持度(32%)最高。因此选择川芎、牛膝、当归作为核心中药。应用网络药理学方法，查寻TCMSP数据库得到川芎、牛膝、当归的活性成分靶点323个，选取GeneCards数据库中KOA前1 000个疾病靶点，通过映射匹配得到共有靶点81个，即确定为川芎、牛膝、牛膝治疗KOA的靶点。将81个靶点基因导入DAVID数据库中进行KEGG通路富集，得到KOA主要通路20个。图4为川芎-牛膝-当归治疗KOA的成分-靶点-通路网络，一共有110个节点，其中成分节点9个，靶点节点81个，通路节点20个。

注：紫色代表成分，橙色代表靶点，绿色代表通路。图4 川芎-牛膝-当归治疗KOA的成分-靶点-通路网络

3 讨论

KOA临床证型常见肝肾亏虚证、脾肾阳虚证、瘀血闭阻证、寒湿凝滞证、湿热阻络证等，多采用补肝肾、强筋骨、祛风湿、活血化瘀等方法[7]。所服中药有经典古方、名老中医经验方、院内制剂等，上述方药的多样性、复杂性和不确定性，对于KOA中药用药规律的阐明带来了诸多困惑。本研究基于数据挖据，分析了50首KOA内服方药的127味中药，发现它们药性多以温、平为主，味多甘、辛，归经以肝、肾、脾经为主。众所周知温性药能够散寒除湿；而甘味能缓、能和、能补，可缓急止痛，补养气血；辛味能行能散，可活血行气，祛风散寒。《张氏医通》云：“膝为筋之府……膝痛无有不因肝肾虚者”，肝藏血主筋，肝血不足则诸筋失养；肾藏精主骨，肾虚则髓海不充骨骼失养，故多数中药归属肝、肾经。用药频次统计显示牛膝、甘草、川芎、当归、独活、杜仲、白芍、丹参、防风、茯苓、秦艽、熟地黄、细辛、薏苡仁为高频使用中药，它们的二联规则分析显示置信度排名前5的药对有防风-牛膝、细辛-川芎、独活-牛膝、桑寄生-牛膝、白芍-甘草，其中川芎-牛膝、当归-牛膝、川芎-当归三个药对的支持度(38%)也最高；三联规则分析仍以川芎、牛膝-当归的支持度(32%)最高。因此本研究认为川芎、牛膝、当归是KOA中药组方的核心药物。

聚类分析发现治疗KOA中药主要分为4类。第1类药物活血止痛、补肝肾强筋骨，包括川芎、细辛、当归、杜仲、桑寄生、牛膝、独活。其中川芎、当归行气开郁、活血止痛；细辛、独活祛风止痛；杜仲、桑寄生、牛膝补肝肾强筋骨，并且牛膝为川牛膝，川牛膝苦酸平，偏于活血祛瘀通络，又可以引诸药下行。《本草正义》曰：“牛膝屈而能达，无微不至，逐邪者，固倚为君，养正者，亦赖以辅佐，所以痿弱痹著，骨痛痉挛诸证，皆不可一日无此也”。此外，治风先治血，血行风自灭，当归、川芎、牛膝诸药合用活血，意在使风邪得祛，气血充盈，肝肾得补，扶正祛邪，标本同治[8]。第2类药物清热解毒、益气养阴，包括甘草、白芍、黄芪。由表2也可以看出“白芍-甘草”药对置信度和支持度都较高。“白芍-甘草”药对着眼于气血的调理，根据虚与实的轻重不一，酌情调整其补泻的配伍，其中药物又多以温补、平补为特点，以归脾经、肝经为主，补泻兼顾，以补为主，反映了“健脾气、养肝血”的构方理念[9]。黄芪常用于气虚乏力半身不遂，痹痛麻木。因此，“白芍-甘草”与黄芪联用治疗气血两虚证、气滞血瘀证、风寒湿凝滞筋骨证、肝肾亏虚证、肝郁血虚证[10]。第3类药物利水渗湿、健脾益气，包括茯苓、白术、熟地黄。白术苦而性燥，味甘补脾，能助脾胃之健运以促生化之源，为健脾益气、燥湿除痹、消食除痞之要药。茯苓和熟地黄具有滋肾健脾、通络止痛的功效。三味药物联用适用于骨痹疼痛，病性虚实夹杂，脾肾两虚，疼痛相对较缓者[11]。第4类药物为薏苡仁，可清热祛湿舒筋，主治下焦湿热之两足麻痿肿痛[12]。

数据挖掘显示核心药物治疗KOA的主要靶点有TNF、IL-6、PTGS2、JUN、AKT1、BAX等，而研究[13]表明IL-6是TNF作用的重要中介物质，能放大和延续KOA的疾病进程，炎症因子TNF可通过与细胞膜上的受体结合，引起MMPs表达增加，导致软骨细胞凋亡、软骨破坏等反应，两者的协同作用可加速KOA的发展。郭静[14]、张其亮[15]发现PTGS2不仅影响体内前列腺素水平，还会增加血管通透性，促进炎性细胞浸润，并可通过NF-KB通路激活并诱导软骨细胞产生IL-6。罗淦[16]发现JUN能够阻断一氧化氮的诱导从而导致软骨细胞凋亡。程亮[17]发现AKT1在骨关节炎软骨细胞中表达下调，对调控细胞的调亡发挥着重要作用。

KEGG通路富集表明PI3K-Akt信号通路、NF-KB信号通路、Toll-样受体信号通路、HIF-1信号通路等是核心药物治疗KOA的主要途径。张媛媛[18]发现PI3K-Akt通路的激活，可使Akt蛋白高度表达，进而调控下游靶蛋白，上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，降低促凋亡蛋白Bax表达，从而抑制软骨细胞凋亡的发生，降低炎症因子水平，延缓软骨细胞的衰老退变，保护并改善关节软骨形态结构，达到预防和治疗KOA的目的。王瑀譞[19]发现NF-KB信号通路以双向方式调节关节软骨的稳态和退化，参与机体的炎症反应、免疫应答，细胞凋亡调节、应激反应等。NF-KB信号通路过度激活，可持续刺激IL-1β、TNF等促炎因子产生，反作用于NF-KB信号通路，进一步导致膝关节软骨破坏，加速KOA发展[20]。ADEREM[21]等发现Toll样受体活化后可通过一系列反应，参与识别PAMPs和DAMPs，诱导多种炎性介质和因子的合成与释放，诱发或加重KOA。Yudoh[22]发现在软骨形成的过程中，HIF-1信号通路能够保护关节软骨，提升软骨细胞的表型以及增加软骨细胞对于缺氧环境的适应性。

总之，本研究分析了KOA内服方剂的用药规律及其核心药物，并揭示了核心药物川芎、牛膝、当归多靶点、多通路治疗KOA的作用机理，为治疗膝骨关节炎用药组方提供了理论参考。