RP-HPLC法测定石榴皮提取物没食子酸、鞣花酸含量研究

范高福，刘 寅，梁延波,，付恩桃，汤 洁

1.合肥职业技术学院 合肥市教育名师工作室(安徽 合肥 238000) 2.上海海虹实业(集团)巢湖今辰药业有限公司(安徽 巢湖 238000)

石榴(PunicagranatumL.) 为落叶灌木或小乔木，是石榴科石榴属植物，别名安石榴、山力叶、丹若等，在我国南北地区均有栽培，而安徽怀远石榴是国家地理标志产品，具有极高的营养价值和保健功效[1-3]。当前石榴主要以品种改良、果品、果饮深加工为主[4]，但加工过程中会产生石榴皮、石榴叶、石榴花、石榴籽等废弃物，而文献报道这些废弃物均含黄酮醇类、多酚类、生物碱及有机酸等多种生物活性成分[5-9]。石榴皮提取物富含多酚类生物活性物质鞣花酸(EA)、没食子酸(GA)、安石榴苷(Pu)，具有抑制氧化、消炎、抑菌杀菌、护肝、抗癌及降血糖等多种药理作用[10-14]。因此，对石榴皮多酚类单体成分提取工艺的优化，进一步拓展石榴皮变废为宝再利用的价值具有广泛的开发应用前景。研究表明[15-16]对多酚类单体成分EA或GA的检测方法较多，但关于安徽本地石榴不同功能部位中鞣花酸、没食子酸等多酚类生物活性物质的含量同时检测的方法尚未见报道，本次实验采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，对本地不同品种石榴皮提取物中GA、EA多酚类物质含量进行同时检测并建立方法学，旨在为安徽本地石榴皮部位的成分的检测标准及其提取物单体的深加工及临床应用提供借鉴的研究方法。

1 材料与仪器

1.1材料与试剂安徽怀远石榴，购自安徽省蚌埠市怀远王氏榴园，经安徽中医药大学药学院彭华胜教授鉴定为石榴科石榴属石榴；石榴GA、EA自制(批号：20190725，石榴皮购自安徽省蚌埠市药材公司，石榴GA、EA提取物干粉经安徽中医药大学现代中药安徽省重点实验室检测，纯度≥90%)EA对照品：纯度≥98%(sigma)；GA对照品：纯度≥98%(sigma)；Milli-Q超纯水，甲醇、乙腈为色谱纯；其余所需试剂均为分析纯；石榴皮干粉及其石榴皮提取物，本实验室自制。

1.2仪器与设备Waters-e2695 HPLC系统：配有2998-PDA检测器(美国沃特世公司)；Mnli-Q Biocel超纯水系统(美国密理博公司)；KL-020S型小型超声波清洗器(深圳科力超声波洗净设备公司)；RE52CS-1型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；ME104E电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；WSY-106数显恒温水浴锅(无锡市石油仪器设备有限公司)；SHZ-95B型实验室循环水真空泵(上海申生仪器抽滤真空泵厂)，FD-1C-50冷冻干燥机(上海比朗仪器有限公司)等。

2 方法与结果

2.1 GA和EA检测的色谱条件色谱柱：Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相含甲醇(A)-0.08%磷酸溶液(B)梯度洗脱(0～9 min，97%B；9～15 min，97%～70%B；15～30 min，70%B)，甲醇冲柱10 min，95%B平衡30 min。流速1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长270 nm，进样体积10 μL[17]。在此色谱条件下，GA、EA特征峰峰型良好，无肩峰、拖尾等现象，见图1。

注：A:GA对照品，B:EA对照品，C:样品白玉石榴皮，D:样品红酸石榴皮。图1 HPLC色谱图

2.2 GA、EA对照品溶液的制备分别快速精密称取GA对照品和EA对照品干粉适量，加50%甲醇溶解定量，配成52.50 μg/mL，50.80 μg/mL的对照品溶液，备用。

2.3 GA、EA检测的供试品石榴皮溶液的制备精密称取干燥石榴皮粉末，经三号筛过筛后，精密称取0.252 0 g，加入容量瓶中，量取50%甲醇25 mL，称重，超声30 min，放冷，称重，用50%甲醇补减失的质量，均匀震摇，通过多次抽滤制得滤液，经微孔滤膜(0.45 μm)精滤制得[18-19]。

2.4检测波长的选择对照品溶液采用二极管阵列检测器PDA进行紫外全波长扫描，吸收轮廓线图谱见图2。结果表明EA在254 nm处有最大吸收(见图2-A)，GA在215 nm和270 nm处有最大吸收(见图2-B)，无干扰峰出现，且分离度较好。同时研读相关文献[17-18]，最终确定270 nm作为EA和GA同时检测波长。

注：A：EA对照品，B：GA对照品。图2 对照品溶液轮廓线扫描图

2.5 GA、EA检测的方法学考察

2.5.1 线性范围 分别精密称定GA、EA对照品干粉适量，加50%甲醇溶解定容至50 mL，摇匀即得。依次通过等度稀释得到不同浓度GA溶液(212.400，106.200，53.100，26.550，13.275，6.637 μg/mL)和EA溶液(213.200，106.600，53.300，26.650，13.325，6.662 μg/mL)，每个浓度均进样10 μL。以溶液浓度为横坐标(X轴)，峰面积为纵坐标(Y轴)制作GA、EA响应的标准曲线，GA回归方程为Y=28 352X+8 233.8(r=0.999 9)，EA回归方程为Y=24 580X+8 857.7(r=0.999 9)。实验结果表明GA在6.637 5～212.400 0呈线性关系，而EA在6.662 5～213.200 0 μg/mL呈线性关系。

2.5.2 精密度试验 称取样品干粉0.25 g，依据2.3项下制备方法配制供试品溶液，设置进样量为10 μL，连续进样6次，测得GA和EA的峰面积RSD分别为0.3%和0.4%，表明该方法精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 量取GA和EA供试品溶液适量，分别在0，1，3，5，7，12，24 h进样，进样量为10 μL，测得GA和EA的峰面积RSD分别为1.0%和1.2%，表明该样品在24 h内稳定性良好。

2.5.4 重复性试验 称取等份样品干粉6份，取样0.25 g，精密称定，依据2.3项下方法配制供试品溶液，测定并计算GA和EA的RSD分别为1.7%和1.9%，表明该样品制备方法具有较好的重复性。

2.5.5 加样回收率试验 称取等份样品干粉6份，精密称定，分别准确加入GA适量，按2.3项下操作，测定含量并计算回收率；另取等份样品干粉6份，精密称定，分别准确加入EA适量，同法操作，见表1。

表1 石榴皮中GA和EA回收率试验

2.5.6 样品含量测定 取安徽蚌埠市怀远产地石榴经典品种2种，分别为白玉石榴(A品种)和红酸石榴(B品种)，依据2.3项下条件各自制备供试品石榴皮待测溶液，采用外标法同时测定石榴皮功能部位中EA与GA的含量，见表2。

表2 安徽怀远石榴皮部位中EA、GA的含量(n=3)

3 讨论

本实验通过反相高效液相色谱法同时检测本地石榴功能部位皮中生物多酚类物质GA、EA含量时，考察了不同溶剂对样品中石榴多酚类物质GA、EA的溶解程度、提取量及提取效率，不同时间对样品的浸渍与超声萃取的影响，不同温度下提取回流及浓缩中抗氧剂维生素C保护作用，结果显示50%甲醇水溶液浸渍样品约12 h，再超声(500 W，40 kHz)萃取30 min，提取回流温度90℃，可有效浸提样品中GA、EA成分；80%丙酮浸渍约6 h，超声(500 W，40 kHz)萃取1h，再用酸化甲醇液有利于石榴皮中游离GA、EA的生成，加入抗氧剂维生素C可减少GA、EA多酚类物质浓缩与纯化过程中的氧化作用，且通过超声预处理样品也可以保护石榴皮提取物的抗氧化特性和生物活性。此外，在溶剂选择上，通过不同浓度乙醇、甲醇、丙酮对石榴皮部位的提取干燥物进行溶解度对比实验，结果发现半极性溶剂甲醇中的溶解度较好，且干扰杂峰较少，有利于石榴皮提取物干粉制备，从而优选甲醇溶剂。

通过比较多个流动相组份(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-三氟乙酸溶液、乙腈-三氟乙酸溶液、甲醇-磷酸溶液)，多个流速(0.5，0.8，1.0 mL/min)，不同进样量(5、10、20 μL)，不同pH值，依据根据色谱的基线、保留时间、分离度、面积、数目等，最终确定EA、GA流动相系统为甲醇-0.08%磷酸溶液梯度，流速1.0 mL/min，10 μL，柱温30℃，通过PDA扫描，2个对照品色谱峰在270 nm均有较强的紫外吸收，优选270 nm作为检测波长，实现样品峰和杂质峰分离。与曲文娟等[20]报道相比，GA保留时间基本一致，均为8～10 min之间，且不容易分离，但本实验采用甲醇提取石榴皮中GA、EA多酚类成分的稳定性更好，且流动相条件设置较为简单易操作。

本课题组采集了安徽怀远地区的不同优良品种石榴皮样品，对其中GA、EA总含量进行了测定，结果分析表明与红酸石榴皮(B品种)相比，白玉石榴皮(A品种)所含GA和EA含量分别增加了0.13%和0.55%，从而为安徽本地石榴皮多酚类物质EA和GA质量控制提供参考。因此，本研究通过RP-HPLC初步建立了同时检测安徽本地不同品种石榴皮中EA、GA含量方法，经方法学验证，该检测方法与现行版《中国药典(2020年版)》0512中有关质量标准具有一致性[21]，且具有准确方便、灵敏稳定、重现性好等优势，可以作为石榴皮功能部位中GA、EA的含量检测方法。