普鲁卡因通过ERK/MAPK/FAK通路抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭

秦文英陈丽华高方方

(河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)麻醉与围术期医学科,河南 洛阳 471002)

骨肉瘤是常见的原发性骨恶性肿瘤,好发于儿童和青少年,易引起严重并发症,导致残疾,严重威胁人类的生命健康[1]。骨肉瘤发病率较高,仅次于脑肿瘤和淋巴瘤,具有恶性程度高、易发生转移的特点,其复发或发生转移会影响预后,降低患者5年生存率[2-3]。目前,甲氨蝶呤、多柔比星、顺铂等常用临床化疗药物在骨肉瘤化疗中出现的耐药性及毒副作用逐渐成为制约其发展的主要问题,而靶向治疗等治疗骨肉瘤的新方法尚处于起步阶段,其有效性及安全性还需大量临床资料证实[4]。因此,寻找一种安全、有效的药物来延缓骨肉瘤进展具有重要价值。普鲁卡因是一种脂溶性局部麻醉药物,已广泛应用于临床麻醉中,近年研究发现,普鲁卡因在肿瘤治疗领域也有一定作用,目前在肺癌、肝癌、胃癌等癌症中已有初步研究[5]。细胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶/黏着斑激酶(extracellular signal regulated kinase/mitogen activated protein kinase/focal adhesion kinase,ERK/MAPK/FAK)通路与多种癌细胞迁移及侵袭密切相关[6-8]。本研究通过研究普鲁卡因对骨肉瘤细胞增殖、迁移及侵袭行为的影响,并探讨可能存在的作用机制。

1 材料和方法

1.1 细胞

人骨肉瘤细胞Saos-2(货号:QY-x646)购自美国ATCC细胞库。

1.2 主要试剂与仪器

普鲁卡因、蛋白提取试剂盒(货号:IP0390-1、BC3640)购自Solarbio;Y15(货号:T7119)购自美国TargetMol;DMEM培养基(货号:KL-P0032)购自德国sigma;CCK-8(货号:CK-04)购自日本同仁;AnnexinV-FITC/PI试剂盒(货号:S0185)购于哈尔滨新海基因检测有限公司;Matrigel基质胶(货号:356234)购自美国BD;结晶紫染液、BCA蛋白测定试剂盒、化学发光试剂盒(货号:E607309-0100、C503021-0500、D601039-0050)购自生工生物工程有限公司;p-ERK抗体、ERK抗体、p-p38 MAPK抗体、p38 MAPK抗体、p-FAK抗体、FAK抗体、GAPDH抗体(货 号:ab223500、ab17942、ab4822、ab31828、ab4792、ab40794、ab181602)购自英国abcam;羊抗兔IgG二抗(货号:0295 G-HRP)购自美国santa;MIR-262-PC培养箱购于日本松下;MODEL550酶标仪及ChemiDocXRS化学发光成像系统购自美国Bio-Rad;BD FACSCanto II流式细胞仪购于美国BD;CX31显微镜购自日本Olympus。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养与分组

人骨肉瘤Saos-2细胞用DMEM培养基,置于培养箱(37℃、5% CO2)内培养,融合75%后,消化、传代培养。

取处于对数生长期的Saos-2细胞,每毫升接种1×105个于96孔培养板,每孔加100 μL,分为对照组、普鲁卡因组、Y15组、普鲁卡因+Y15组,对照组为不含药物的完全培养液,普鲁卡因组加终浓度为2 μmol/L的普鲁卡因,Y15组加入终浓度为10 μmol/L的Y15,普鲁卡因+Y15组加入终浓度为2 μmol/L的普鲁卡因及终浓度为10 μmol/L的Y15[9]。

1.3.2 CCK-8法检测各组Saos-2细胞增殖情况

将Saos-2细胞按照1.3.1分组处理后分别培养24、48和72 h,加CCK-8,培养2 h,酶标仪(450 nm)检测吸光度(OD)值。药物处理组按下列公式计算细胞存活率(%)=OD药物处理组/OD对照组×100%

1.3.3 流式细胞仪测定各组Saos-2细胞凋亡情况

Saos-2细胞按照1.3.1分组处理,培养48 h,细胞收集、消化、洗涤,使用结合缓冲液调整为每毫升1×106个的细胞悬液,按照相应试剂盒说明书步骤,依次加入Annexin V-FITC、PI各5 μL,黑暗处孵育1 h,流式细胞仪测定Saos-2细胞的凋亡率。

1.3.4 Transwell法检测各组Saos-2细胞迁移情况

用无血清培养液将1.3.1中各组Saos-2细胞稀释为每毫升2.0×105个细胞的悬液,向Transwell小室上室加200 μL,下室加10%胎牛血清的培养液500 μL,在37℃、5% CO2培养箱中孵育24 h,擦去未穿膜细胞,用4%多聚甲醛10 min,PBS洗涤,0.5%结晶紫染液染色20 min,PBS洗涤。倒置在200倍镜的显微镜下,随机选取6个视野,观察并拍照,统计迁移细胞数,计算平均值。

1.3.5 Transwell法检测各组Saos-2细胞侵袭情况

用无血清培养基以1∶8的比例稀释Matrigel基质胶,向Transwell小室上室中加50 μL,37℃过夜凝固,后续操作按照1.3.4中细胞迁移情况检测步骤进行操作,随机选6个视野,统计侵袭细胞数,计算其平均值。

1.3.6 蛋白印迹(Western blot)法检测各组Saos-2细胞中ERK/MAPK/FAK通路相关蛋白表达情况

将Saos-2细胞按照1.3.1分组处理,培养48 h,细胞收集、提取总蛋白、定量。电泳分离蛋白并转至PDVF膜,含5%脱脂奶粉的TBST进行封闭1,分别加入p-ERK抗体(1∶500)、ERK抗体(1∶500)、p-p38 MAPK抗体(1∶500)、p38 MAPK抗体(1∶500)、p-FAK抗体(1∶500)、FAK抗体(1∶500)、GAPDH抗体(1∶500),4℃过夜,洗涤,加羊抗兔IgG二抗(1∶5000),常温孵育1 h,发光法显色后拍摄图像,分析条带的灰度值。

1.4 统计学方法

使用SPSS 24.0统计学软件处理数据。符合正态分布的计量资料用平均数±标准差(±s)表示,多组间比较进行单因素方差分析,两两比较进行SNKq检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组Saos-2细胞增殖情况

与对照组相比,普鲁卡因组、Y15组、普鲁卡因+Y15组Saos-2细胞存活率均显著降低(P＜0.05);与普鲁卡因组相比,普鲁卡因+Y15组Saos-2细胞存活率均显著降低(P＜0.05)。与Y15相比,普鲁卡因+Y15组Saos-2细胞存活率的差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 各组Saos-2细胞存活率比较(±s,n=6)Table 1 Comparison of Saos-2 cell survival rates in each group

表1 各组Saos-2细胞存活率比较(±s,n=6)Table 1 Comparison of Saos-2 cell survival rates in each group

注:与对照组相比,*P＜0.05;与普鲁卡因组相比,#P＜0.05;与Y15组相比,$P＜0.05。Note.Compared with the control group,*P＜0.05.Compared with the procaine group,#P＜0.05.Compared with the Y15 group,$P＜0.05.

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2.2 各组Saos-2细胞凋亡情况

与对照组相比,普鲁卡因组、Y15组、普鲁卡因+Y15组Saos-2细胞凋亡率均显著升高(P＜0.05);与普鲁卡因组相比,普鲁卡因+Y15组Saos-2细胞凋亡率均显著升高(P＜0.05)。与Y15相比,普鲁卡因+Y15组Saos-2细胞凋亡率的差异无统计学意义(P＞0.05)。见图1、表2。

图1 各组Saos-2细胞凋亡情况Figure 1 Apoptosis of Saos-2 cell in each group

表2 各组Saos-2细胞凋亡率比较(±s,n=6)Table 2 Comparison of Saos-2 cell apoptosis rates in each group

表2 各组Saos-2细胞凋亡率比较(±s,n=6)Table 2 Comparison of Saos-2 cell apoptosis rates in each group

注:与对照组相比,*P＜0.05;与普鲁卡因组相比,#P＜0.05;与Y15组相比,$P＜0.05。Note.Compared with the control group,*P＜0.05.Compared with the procaine group,#P＜0.05.Compared with the Y15 group,$P＜0.05.

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2.3 各组Saos-2细胞迁移情况

与对照组相比,普鲁卡因组、Y15组、普鲁卡因+Y15组Saos-2细胞迁移细胞数均显著升高(P＜0.05);与普鲁卡因组相比,普鲁卡因+Y15组Saos-2细胞迁移细胞数均显著升高(P＜0.05)。与Y15相比,普鲁卡因+Y15组Saos-2细胞迁移细胞数的差异无统计学意义(P＞0.05)。见图2、表3。

表3 各组Saos-2细胞迁移细胞数比较(±s,n=6)Table 3 Comparison of Saos-2 cell migration numbers in each group

表3 各组Saos-2细胞迁移细胞数比较(±s,n=6)Table 3 Comparison of Saos-2 cell migration numbers in each group

注:与对照组相比,*P＜0.05;与普鲁卡因组相比,#P＜0.05;与Y15组相比,$P＜0.05。Note.Compared with the control group,*P＜0.05.Compared with the procaine group,#P＜0.05.Compared with the Y15 group,$P＜0.05.

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图2 各组Saos-2细胞迁移情况Figure 2 Migration of Saos-2 cell in each group

2.4 各组Saos-2细胞侵袭情况

与对照组相比,普鲁卡因组、Y15组、普鲁卡因+Y15组Saos-2细胞侵袭细胞数均显著升高(P＜0.05);与普鲁卡因组相比,普鲁卡因+Y15组Saos-2细胞侵袭细胞数均显著升高(P＜0.05)。与Y15相比,普鲁卡因+Y15组Saos-2细胞侵袭细胞数的差异无统计学意义(P＞0.05)。见图3、表4。

表4 各组Saos-2细胞侵袭细胞数比较(x¯±s,n=6)Table 4 Comparison of Saos-2 cell invasion numbers in each group

图3 各组Saos-2细胞侵袭情况Figure 3 Invasion of Saos-2 cell in each group

2.5 各组Saos-2细胞中ERK/MAPK/FAK通路相关蛋白表达情况

与对照组相比,普鲁卡因组、Y15组、普鲁卡因+Y15组Saos-2细胞中p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-FAK/FAK蛋白表达水平均显著降低(P＜0.05);与普鲁卡因组相比,普鲁卡因+Y15组Saos-2细 胞 中p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-FAK/FAK蛋白表达水平均显著降低(P＜0.05);与Y15相比,普鲁卡因+Y15组Saos-2细胞中p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-FAK/FAK蛋白表达水平的差异无统计学意义(P＞0.05)。见图4、表5。

表5 各组Saos-2细胞中ERK/MAPK/FAK通路相关蛋白表达情况比较(±s,n=6)Table 5 Comparison of ERK/MAPK/FAK pathway-related protein expression of Saos-2 cell in each group

表5 各组Saos-2细胞中ERK/MAPK/FAK通路相关蛋白表达情况比较(±s,n=6)Table 5 Comparison of ERK/MAPK/FAK pathway-related protein expression of Saos-2 cell in each group

注:与对照组相比,*P＜0.05;与普鲁卡因组相比,#P＜0.05;与Y15组相比,$P＜0.05。Note.Compared with the control group,*P＜0.05.Compared with the procaine group,#P＜0.05.Compared with the Y15 group,$P＜0.05.

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图4 Western blot检测各组Saos-2细胞中ERK/MAPK/FAK通路相关蛋白表达情况Figure 4 Western blot analysis of ERK/MAPK/FAK pathway-related protein expression of Saos-2 cell in each group

3 讨论

骨肉瘤起源于骨间叶细胞,是常见的原发性恶性肿瘤,含有大量未成熟的骨或骨样组织,恶性程度高且易发生转移[10]。目前通常采用手术切除转移灶、放化疗及分子靶向疗法等对骨肉瘤进行治疗,都具有一定治疗效果。然而,这些治疗手段仍存在一定缺陷,例如,手术疗法容易产生较大创伤,放化疗法的敏感性相对不高,且化疗具有明显的不良反应,明显降低了患者的生存质量,而分子靶向疗法的治疗费用相对较昂贵,易对患者造成巨大的经济负担[11-13]。临床研究表明,骨肉瘤的高转移率和高复发率是骨肉瘤治疗的主要问题[14-15]。因此,探索能够干预骨肉瘤发生发展的新治疗手段迫在眉睫,一些高效、安全、便宜的可能用于骨肉瘤治疗的药物逐渐引起了人们的关注。

普鲁卡因是一种局部麻醉药物,在临床麻醉中,具有麻醉效果好、药物毒性低等优点。近年研究发现,普鲁卡因可以对肿瘤细胞进行DNA去甲基化,可以增加几种常用抗癌药物的抗肿瘤活性,对放射治疗具有增敏作用[5]。然而,普鲁卡因在骨肉瘤中的研究尚不完善。Ying等[16]研究发现,普鲁卡因能够通过上调microRNA-133b表达抑制骨肉瘤细胞增殖和迁移,并促进细胞凋亡。本研究结果显示,普鲁卡因组Saos-2细胞存活率、迁移细胞数、侵袭细胞数较对照组均显著降低,细胞凋亡率较对照组均显著升高,表明普鲁卡因对Saos-2细胞增殖、迁移、侵袭均具有明显的抑制作用。

ERK/MAPK/FAK通路是肿瘤发生迁移、侵袭的常见信号通路,在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用,其中ERK、p38 MAPK、FAK是这一通路的重要成员,激活后可产生、分泌多种细胞因子,通过抑制肿瘤抑制因子活化,在肿瘤形成的任何时期均可发挥促进恶性肿瘤细胞存活及转移的作用[9]。苏小桃等[17]研究表明,二甲双胍可抑制骨肉瘤MG63细胞的迁移和侵袭能力,可能是通过下调埃兹蛋白和MAPK/Erk信号通路而实现。曹飞等[18]研究表明,赖氨酸羟化酶2促进骨肉瘤迁移和侵袭的机制可能与激活FAK/JAK2-STAT3信号通路有关。Yang等[19]研究发现,FAK可能通过促进上皮-间质转化相关转录因子表达促进肿瘤的侵袭和转移。既往研究发现,化疗的辅助药物普鲁卡因,对脂多糖诱导的结肠癌细胞迁移、侵袭具有抑制作用[20]。本研究结果显示,普鲁卡因组Saos-2细胞中p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-FAK/FAK

蛋白表达水平较对照组均显著降低,表明在骨肉瘤细胞中普鲁卡因可影响ERK、p38 MAPK、FAK的磷酸化过程。Y15是ERK/MAPK/FAK通路抑制剂,可通过抑制FAK磷酸化,进而影响ERK、p38 MAPK的磷酸化过程。本研究使用Y15处理Saos-2细胞,发现Saos-2细胞存活率、迁移细胞数、侵袭细胞数均显著降低,表明ERK/MAPK/FAK通路确实是Saos-2细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的关键通路。在使用Y15处理基础上,在使用普鲁卡因处理Saos-2细胞,发现Saos-2细胞的存活率、迁移细胞数、侵袭细胞数较单独使用Y15处理无显著变化,推测普鲁卡因对Saos-2细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭过程的影响可能是通过抑制ERK/MAPK/FAK通路激活发挥作用的。

综上所述,普鲁卡因可能通过抑制ERK/MAPK/FAK通路激活抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭,这为普鲁卡因用于临床治疗骨肉瘤患者奠定了理论基础。但体外环境不能完全代表体内环境,普鲁卡因的抗骨肉瘤增殖、迁移、侵袭作用在动物体内是否效果依旧还需进一步设计动物实验验证。