miR-452-5p 靶向SOX5 调控信号通路对乳腺癌细胞增殖与侵袭的影响

魏 涛，冯连杰，付小娜，赵世杰，刘伟鹏，梁 豪

乳腺癌患者的死亡多由局部肿瘤转移引起［1］，在肿瘤转移过程中，侵袭性癌细胞的增殖程序受基因的调控［2］。miRNA 是一类内源性非编码小RNA，可通过与靶基因结合，调控蛋白的表达和细胞功能。已有研究发现，miR-452-5p 可抑制乳腺癌细胞转移［3］，miR-485-5p 通过靶向survivin 抑制乳腺癌的进展和化学敏感性［4］。在细胞中，小RNA 通过与靶基因的3'-未翻译区互补结合抑制基因表达，研究显示，miR-146a-5p 通过调控SOX5 的表达影响三阴性乳腺癌细胞的增殖和转移［5］。SOX5 作为癌基因发挥作用，抑制SOX5 的表达可抑制非小细胞肺癌和前列腺癌的发展［6，7］。SOX5 被证明是由多个小RNA 调控的，但在乳腺癌中，miR-452-5p 是否调控SOX5 还没有研究。笔者通过检测miR-452-5p、SOX5 的表达，探讨miR-452-5p 对乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 材料人乳腺上皮细胞株HBL-100、人乳腺癌MCF-7、SKBR-3、BT549 细胞株（上海细胞库）；胎牛血清、RPMI 1640 培养基（美国Gibco 公司）；Tranwell 小室（美国Millipore 公司）；Matrigel 胶（美国BD 公司）；MTT、DMSO（美国Sigma 公司）；miRcon、miR-con mimic 的构建（上海吉凯基因公司）；SOX5、Cyclin D1、CDK4、MMP-2、MMP-9 一抗（美国Abcam 公 司）；Twist、N-cadherin、Vimentin、βactin 抗体（美国CST 公司）；lipofectamine TM2000转染试剂（美国invitrogen 公司）；SOX5 过表达载体及空载体、SOX5 野生型（WT）或突变型（MUT）荧光素酶报告载体（广州复能基因有限公司）；miR-452-5p、SOX5 引物（上海生工公司）；IgG 二抗（北京博奥森生物科技有限公司）；RIPA 裂解液、BCA 蛋白检测试剂盒（美国Thermo scientificals 公司）；酶标仪购自Bio-Red 公司；电子荧光显微镜购自日本Olympus 公司；Western blot 发光成像系统（美国UVP公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞的培养与分组 HBL-100、MCF-7、SKBR-3、BT549 细胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。实验首先分为空白对照组（NC），阴性对照组（miRcon），miR-452-5p 过表达组（miR-452-5p mimic）；miR-con 组：将miR-con 转染至SKBR-3 细胞中；miR-452-5p mimic 组：将miR-452-5p mimic 转染至SKBR-3 细胞中。后续实验分为miR-con 组，miR-452-5p mimic 组，miR-452-5p+pcDNA 组，miR-452-5p+pcDNA-SOX5 组；miR-452-5p +pcDNA 组，将pcDNA空载体转染miR-452-5p mimic 细胞；miR-452-5p+pcDNA-SOX5 组，将pcDNA-SOX5 载体转染miR-452-5p mimic 细胞，比较2 组间检测数据的差异。

1.2.2 细胞转染 miR-452-5p mimic、miR-con 使用lipofectamineTM2000 转染试剂进行转染，转染后6 h 后更换培养基，荧光显微镜下观察转染效率；pcDNA-SOX5 通过慢病毒转染细胞。

1.2.3 实时荧光定量PCR 细胞中提取总RNA，反转录为cDNA，荧光定量PCR 仪进行实时荧光定量PCR，反应参数设置为95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40 个循环。以U6 和β-actin 分别为miR-452-5p、SOX5 的内参基因，采用2-ΔΔct方法计算miR-452-5p、SOX5 的相对表达量，实验重复3 次取平均值。引物序列：miR-452-5p：F 5'-GACCCAATACGAGTCGGCAATTCCA ACT-3'，R 5'-GCGAGGTCAAGTCACTAGTGGT-3'；U6：F 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R 5'-AACG CTTCACGAATTTGCGT-3'；SOX5：F 5'-CAGCCAG AGTTAGCACAATAGG-3'，R 5'-CTGTTGTTCCCGT CGGAGTT-3'；β-actin：F 5'-GGAGCGAGATCCCT CCAAAAT-3'，R 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCAT GG-3'。

1.2.4 MTT 法检测细胞增殖情况 调整SKBR-3细胞浓度至5×104个/ml，96 孔板每孔加入100 μl细胞悬液，分别于24 h，48 h，72 h 检测细胞活力；每孔加入MTT 试剂20 μl，继续培养4 h，离心保留下层细胞，每孔加入100 μl DMSO，锡箔纸包裹震荡孵育15 min，酶标仪检测490 nm 波长的吸光度。

1.2.5 Transwell 实验检测乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力 Transwells 小室接种5×104个SKBR-3 细胞，培养24 h 后检测迁移至小室膜细胞数，200 倍光镜下随机选取5 个视野比较穿膜细胞数。Matrigel包被小室基底膜，其余步骤与迁移实验相同，检测细胞侵袭能力。实验均独立重复3 次。使用相同方法检测miR-con 组，miR-452-5p mimic 组，miR-452-5p+pcDNA 组，miR-452-5p+pcDNA-SOX5 组SKBR-3 细胞的迁移侵袭能力。

1.2.6 双荧光素酶实验检测miR-452-5p 对SOX5的影响 构建野生型pGL3-SOX5-3’UTR（wt-SOX5 3’UTR）和突变型pGL3-SOX5-3’UTR（mutpGL3-SOX5-3’UTR）表达载体转染至miR-con、miR-452-5p mimic SKBR-3 细胞，转染后48 h 裂解细胞，双荧光素酶检测系统检测双荧光素酶活性，检测miR-452-5p 对SOX5 荧光活性的调控。

1.2.7 采用蛋白印迹（western blot，WB）法检测蛋白表达情况 RIPA 裂解液裂解细胞，提取细胞中总蛋白，BCA 试剂盒测定蛋白浓度；SDS 变性蛋白；电泳转膜封闭1，一抗以1∶500 稀释后4 ℃孵育过夜，二抗孵育1 h，ECL 显影液显影，AI600 成像系统观察目的蛋白条带，Image J 软件对目的条带进行灰度值分析，以β-Actin 为内参进行灰度值比较。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0 进行数据分析。2 组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用snk-q 检验；以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-452-5p 和SOX5 在乳腺癌细胞系中的表达RT-qPCR 检测结果显示，乳腺癌细胞系MCF-7、SKBR-3、BT549 中miR-452-5p 表达显著低于正 常乳腺癌细胞系HBL-100（P＜0.05），且SKBR-3 细胞中miR-452-5p 表达水平最低（图1A）。乳腺癌细胞系MCF-7、SKBR-3、BT549 中SOX5 mRNA 及蛋白水平显著高于HBL-100（P＜0.05），且SKBR-3 细胞中SOX5 mRNA 及蛋白水平均最高（图1B～D），选择乳腺癌细胞系SKBR-3 进行后续功能实验。

图1 miR-452-5p、SOX5 在乳腺癌细胞系中的表达

2.2 转染miR-452-5p 抑制乳腺癌SKBR-3 细胞增殖在SKBR-3 细胞中分别转染 miR-con、NC和miR-452-5p mimic，RT-qPCR 检测显示，与NC、miR-con 组比较，转染miR-452-5p mimic 后，乳腺癌SKBR-3 细胞miR-452-5p 表达水平显著升高（P＜0.05）（图2A）。MTT 检测显示，与NC、miR-con组比较，过表达miR-452-5p 后乳腺癌SKBR-3 细胞活性显著降低（P＜0.05）（图2B）。Western blot 结果显示，与NC、miR-con 组比较，过表达miR-452-5p 后，细胞周期蛋白Cyclin D1、CDK4 表达水平显著降低（P＜0.05）（图2C、D）。

图2 转染miR-452-5p 对乳腺癌细胞增殖的影响

2.3 转染miR-452-5p 抑制乳腺癌SKBR-3 细胞迁移和侵袭Transwell 侵袭实验显示，与NC、miR-con 组比较，转染miR-452-5p mimic 组乳腺癌SKBR-3 细胞迁移和侵袭数量显著降低（P＜0.05）（图3A、B），提示miR-452-5p 能够抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭。Western blot 结果显示，与NC、miR-con 组比较，过表达miR-452-5p 后，乳腺癌SKBR-3 细胞中与侵袭、转移密切相关的MMP-2、MMP-9 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）（图3C、D）。

图3 转染miR-452-5p 对抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响

2.4 miR-452-5p 靶向SOX5TargetScan 软件预测miR-452-5p 与SOX5 3’UTR 存在结合位点（图4A），荧光素酶实验进一步验证miR-452-5p 与SOX53’UTR 关系，根据预测结果构建SOX5-WT-3’UTR 和SOX5-MUT-3’UTR 质粒，分别与miR-452-5p mimic 或miR-452-5p NC 共转染至SKBR-3 细胞，荧光素酶报告基因显示，只有SOX5-WT--3’UTR 与miR-452-5p mimic 共转染组的荧光素酶活性显著降低（P＜0.05），其余三组荧光素酶活性无明显差异，提示miR-452-5p 可与SOX5 特异性结合（图4B）。Western blot 结果显示，过表达miR-452-5p 后SOX5 表达显著减少，沉默miR-452-5p后SOX5 表达显著升高（P＜0.05）（图4C）。

图4 miR-452-5p 靶向SOX5

2.5 过表达SOX5 降低miR-452-5p 对乳腺癌SKBR-3 细胞的抑制作用MTT 检测显示，与miR-con 组比较，过表达miR-452-5p 后，miR-452-5p 组乳腺癌SKBR-3 细胞增殖活性受到抑制，迁移数和细胞侵袭数显著减少，SOX5、Cyclin D1、CDK4、MMP-2、MMP-9 蛋白水平均显著降低（P＜0.05）；过表达SOX5 后，与miR-452-5p+pcDNA 组比较，miR-452-5p+pcDNA-SOX5 组细胞活性显著增加、迁移和侵袭数显著增加，SOX5、Cyclin D1、CDK4、MMP-2、MMP-9 蛋白水平显著增加（P＜0.05）（图5）。

图5 过表达SOX5 部分逆转miR-452-5p 抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭

2.6 miR-452-5p 调控SOX5 影响乳腺癌SKBR-3细胞中Twist1 信号通路和EMT 的发生Western blot 结果显示，与miR-con 组比较，过表达miR-452-5p 后，Twist、N-cadherin、Vimentin 蛋白水平显著降低，E-cadherin 水平显著升高（P＜0.05）；过表达SOX5 后，与miR-452-5p 组比较，miR-452-5p+pcDNA-SOX5 组Twist、N-cadherin、Vimentin 蛋 白水平显著增加，E-cadherin 水平显著降低，miR-452-5p+pcDNA 组各蛋白水平与miR-452-5p 组无显著变化（图6）。

图6 miR-452-5p 调控SOX5 影响乳腺癌细胞中AKT 信号通路

3 讨论

乳腺癌进展缓慢，但仍是引起女性癌症死亡的主要原因［8］。目前关于乳腺癌的治疗主要有手术、化疗、放疗、激素治疗和靶向治疗。随着对乳腺癌研究的深入，目前的治疗方法极大地改善了患者的预后，但是耐药性和肿瘤细胞复发转移仍然限制了当前治疗方法的有效性。

miRNA 是一类长约20～25 个核苷酸的内源性非编码小RNA，通过碱基互补配对的方式与靶基因结合，调控基因的表达。有研究报道，提高miR-452-5p 的表达可抑制肝癌细胞的恶性侵袭和迁移［9］。该研究结果显示，miR-452-5p 在乳腺癌细胞中低表达，过表达miR-452-5p 可抑制细胞的增殖、侵袭和转移，与上述研究结果相似，提示miR-452-5p 在乳腺癌细胞中发挥抑癌基因作用。

Cyclin D1 调控细胞增殖周期的G1-S 过程，其在正常组织中不表达或者低表达，在恶性肿瘤组织中高表达［10］。CDK 也是调节细胞周期的重要蛋白，包括CDK1～7，CDK 蛋白的激活依赖于Cyclin 的结合［11］。CDK4 是细胞增殖周期G1-S 过程的重要成分，其在肿瘤和细胞系中异常高表达［12］。研究报道，喉癌细胞中Cyclin D1、CDK4 表达水平显著高于正常喉上皮细胞，抑制Cyclin D1 或CDK4 表达后喉癌细胞的增殖受到抑制［13］。该研究中过表达miR-452-5p 后，乳腺癌SKBR-3 细胞Cyclin D1、CDK4蛋白水平显著降低，提示miR-452-5p 发挥抑癌基因作用，阻滞细胞的增殖。

MMPs 活化可促进细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）降解，促进癌细胞的侵袭和转移［14］。研究报道，MMP-2、MMP-9 在人卵巢黏液囊腺上皮癌细胞高表达，其表达水平与细胞的恶性程度，侵袭和转移密切相关［15］。该研究中过表达miR-452-5p后，乳腺癌SKBR-3 细胞MMP-2、MMP-9 蛋白水平显著降低，提示过表达miR-452-5p 可抑制细胞侵袭和转移能力，进一步验证了miR-452-5p 的抑癌作用。

TargetScan 软件预测miR-452-5p 与SOX5 3’UTR 存在结合位点，该研究进一步采用双荧光素酶实验验证显示，miR-452-5p 靶向调控SOX5 的表达。SOX 家族可编码包括SOX1～15、17、18、21、30等一系列转录因子，SOX5 基因位于染色体12p12.1区域，其在细胞生长、增殖、分化中发挥重要作用［16］。近年来发现，SOX5 作为癌基因在前列腺癌、三阴性乳腺癌等几种癌症中高表达［5，7］。该研究结果显示，SOX5 在乳腺癌细胞系中的表达水平显著高于正常乳腺癌细胞，与上述研究结果一致，提示SOX5 在乳腺癌中发挥癌基因作用。研究表明，SOX5 可以被小RNA 调控，在前列腺癌细胞中，miR-139-5p 的升高导致SOX5 表达下降［17］。该研究中过表达miR-452-5p 后，乳腺癌SKBR-3 细胞SOX5 蛋白水平显著降低，提示miR-452-5p 可调控SOX5 的表达。研究报道，过表达SOX5 可促进胃癌细胞的增殖和侵袭［18］。该研究中过表达SOX5 后发现，细胞的增殖活性显著增强，细胞迁移和侵袭数显著增加，SOX5、Cyclin D1、CDK4、MMP-2、MMP-9 蛋白水平显著增加，提示过表达SOX5，可降低miR-452-5p 对乳腺癌细胞的增殖抑制、侵袭和迁移抑制作用。恶性肿瘤的发展是多因素、多步骤的病理变化，有研究报道，Twist信号通路、EMT 过程与多种肿瘤细胞的侵袭转移途径相关，调节前列腺癌细胞中SOX5 的表达，可以抑制Twist 表达进而抑制EMT 过程［19］。该研究中过表达miR-452-5p 后，Twist、N-cadherin、Vimentin 蛋白水平显著降低，E-cadherin 水平显著升高，EMT进程受到抑制。过表达SOX5 后，Twist、N-cadherin、Vimentin 蛋白水平显著增加，E-cadherin 水平显著降低，减弱miR-452-5p 对EMT 的抑制作用，提示可通过调节SOX5 表达调控EMT 过程。从机制上讲，miR-452-5p 调控SOX5 的表达，抑制EMT 过程，抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移，为miR-452-5p作为乳腺癌的治疗靶点提供有力的理论依据。

综上所述，该研究初步证实miR-452-5p 可能通过靶向SOX5 调控Twist 信号通路进而抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移，其机制可能与Twist 通路相关。