EM菌剂与EDTA配施对铜、铅复合污染下黑麦草种子萌发和生长及重金属吸收的影响

周红艳，陈丽珊，黄艳清

(福建农业职业技术学院，福建 福州 350119)

根据2014年《全国土壤污染状况调查公报》显示，我国土壤重金属污染形势非常严峻，其中铜、铅、镉的超标率分别为1.5%、2.1%、7.0%。重金属由于在环境中难以降解，而且对农作物生长和人类健康均有极大的危害[1]。环境中的铅和铜是国家标准中严格控制的重金属，因铅、铜进入土壤后不易溶解、持久存在于环境中，可经生物链汇集在人体内，通过食物链对人体造成严重的危害。因此，对土壤中重金属铅和铜的去除已经成为刻不容缓的问题。目前，重金属污染的修复主要采用植物修复、化学修复、微生物修复和综合修复技术等。植物修复技术作为一项高效、经济、无污染的土壤净化技术越来越受到人们的重视，已成为环境科学领域的研究热点[2-3]。但是，由于土壤环境中重金属溶解度低、迁移性差及重金属向植物地上部转运效率不高等原因影响了植物的修复效果。而非生物螯合剂如EDTA是目前广泛应用的一种螯合剂，能够活化Pb、Cd、Zn、Cu等多种重金属离子，促进植物对这些离子的超量吸收和富集，使植物修复重金属污染技术的效果大大提高，其对Pb的活化效果最好[4]。

此外，微生物在自然界内种类繁多，并在重金属元素的生物地球化学循环中扮演着重要的角色。目前，应用微生物联合植物修复是土壤重金属污染修复理论研究和应用实践的新思路[5]。EM复合菌剂是由光合菌、酵母菌、乳酸菌等80多种厌氧性或好氧性微生物复合培养而成，自20世纪80年代初问世以来，EM技术已在60多个国家推广和应用。施用EM可以达到对重金属污染土壤进行微生物修复、降低重金属含量、改善品质的目的[6]。而且由多种微生物共生而成的复合功能菌群，往往聚集了许多微生物的特征，对于一些结构非常复杂的污染物，其修复效果远高于单一微生物，从而在污染环境修复中显示出巨大的应用潜力[7]。Singh等[8]研究了复合菌群去除有害的微量金属的效果，结果表明：该复合菌群去除了多达80%的Ni、Zn、Cu、Cd、Cr，以及接近45%的Pb。这些研究表明混合菌群能够高效、全面地实现对重金属复合污染环境的修复。

采用EDTA螯合剂与EM复合菌剂共同诱导植物修复重金属污染是一个值得探讨的研究领域，但迄今为止，利用EM复合菌剂与螯合剂EDTA的联合施用，对重金属铅、铜复合污染下黑麦草修复效应方面的应用研究在国内鲜见报道。而且目前大部分是关于种子萌发、种子幼苗生长、发芽率等方面的研究，关于重金属吸收情况的研究极少，采用水培方法可以全面分析在萌发阶段重金属的变化和幼苗生长、种子萌发之间的关系。另外，对于EDTA浓度在不同植物、不同生育期、不同重金属环境胁迫下的使用浓度上存在较大的争议。为此，笔者研究了EDTA螯合剂与EM复合菌剂对铜、铅胁迫下黑麦草种子萌发、生长及重金属铜、铅吸收的影响，旨在为重金属复合污染下采用多种方法联合修复重金属提供技术支撑和理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

黑麦草种子由千聚源种业公司提供；EM复合菌剂由江西天意生物技术有限公司提供；EDTA(乙二胺四乙酸二钠盐)由天津市化学试剂批发公司提供。

1.2 试验设计

试验前将黑麦草种子用0.2%次氯酸钠消毒10 min，用蒸馏水反复冲洗数遍，浸种3 h后，挑选饱满的种子，将水吸干放入直径为9 cm的培养皿，皿内放相应大小的滤纸二层作为发芽床，每皿放入100粒种子。将配制好的EDTA、EM和硝酸铅、硫酸铜溶液倒入培养皿，使得每个处理的Pb、Cu的最终浓度分别为200、250 μg/mL。每日采用称重法加水至恒重，培养温度为25 ℃，光照、黑暗周期分别为16、8 h。

试验按两因素完全随机区组设计。设置6个处理，每个处理3次重复。EDTA和EM最终浓度如下。处理1：不加EDTA和EM，用水替代，保证铅、铜浓度一致(CK)；处理2：EM 100倍液(EM 100)；处理3：EDTA 2.5 mmol/L(EDTA 2.5)；处理4：EDTA 2.5 mmol/L+EM 100倍液(EDTA 2.5+EM 100)；处理5：EDTA 1.25 mmol/L+EM 100倍液(EDTA 1.25+EM 100)；处理6：EDTA 6 mmol/L+EM 100倍液(EDTA 6+EM 100)。

1.3 试验方法

1.3.1 发芽和幼苗生长的统计方法 每天观察生长情况，并按以下公式计算发芽率、发芽势。

发芽率/%=(第10天正常发芽种子数/供试种子数)×100%

发芽势/%=(第4天正常发芽种子数/供试种子数)×100%

第10天每皿随机选取10株测量幼苗的根长、芽长，并取平均值；地上部鲜重，分别用剪刀取每株地上部称重，每个处理3次重复。

1.3.2 重金属Pb和Cu含量的测定方法

1.3.2.1 铅标准曲线绘制 用硝酸铅标准溶液10 μg/mL配制成浓度为0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 μg/mL的标准溶液，参照液体类样品铅含量检测国标GB 5009.12─2017第三法火焰原子吸收法，用MIBK萃取铅导入TAS-990F型原子吸收分光光度计(北京普析仪器公司)进行测定，按浓度与吸光度对应关系绘制标准曲线，曲线方程：A=0.0245C+0.0362(r=0.9998)。

1.3.2.2 铜标准曲线绘制 参照铜检测国标GB 5009.13─2017第二法火焰原子吸收法，分别吸取0.0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL铜标准使用液(10.0 μg/mL)，分别置于50 mL容量瓶中，加5%硝酸稀释至刻度，混匀。将样液稀释后和各容量瓶中铜标准液分别导入调至最佳条件的TAS-990F型原子吸收分光光度计测定，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到浓度与吸光度对应关系的曲线方程：A=0.1275C-0.0008(r=0.9996)。

1.3.2.3 样品测定与仪器条件 试验用水全为超纯水，所使用玻璃器皿均用20% HNO3溶液浸泡24 h以上，然后用蒸馏水洗净，晾干后使用。第10天每个培养皿吸取0.3 mL溶液与标准溶液相同方法检测重金属铅的含量，铜测定液经稀释后与标准溶液同样条件进行测定。

原子吸收分光光度计测铅仪器工作条件：燃气组成为空气-乙炔，检测波长283.3 nm，光谱带宽0.4 nm，灯电流2 mA，乙炔流量1200 mL/min，空气流量8 L/min，燃烧器高度7.5 mm。

测铜仪器工作条件：燃气组成为空气-乙炔，检测波长324.8 nm，光谱带宽0.5 nm，灯电流8 mA，乙炔流量1600 mL/min，空气流量9 L/min，燃烧器高度6 mm。

1.3.3 总酚、类黄酮含量的测定方法 取0.1000 g叶片，加入预冷的1% HCL甲醇溶液，然后于4 ℃浸提24 h，取浸提液经80%的甲醇稀释后测定280 nm、325 nm处的OD值。总酚含量以没食子酸标准曲线加以计算，类黄酮含量以OD325/g FW表示。

1.4 数据处理与分析

试验所得数据用Excel 2016软件进行整理，采用SPSS软件，对芽长、根长、鲜重、发芽势、发芽率、总酚、类黄酮含量、重金属铜、铅含量进行方差分析和多重比较，P<0.01表示差异达极显著水平，P<0.05表示差异达显著水平。

2 结果与分析

2.1 EM菌剂与EDTA配施对铜、铅复合污染下黑麦草种子萌发的影响

发芽势和发芽率是反映种子活力非常重要的指标。由图1可知，在铜、铅复合污染胁迫下，不同浓度EM菌剂与EDTA处理对黑麦草种子发芽势和发芽率的影响达显著(P<0.05)或极显著水平(P<0.01)。单独使用EM菌剂(处理2)、EDTA(处理3)与CK相比，其发芽势和发芽率都有明显的提高。EM菌剂与EDTA配合使用时，3种处理组合浓度表现为EDTA 2.5+EM 100(处理4)>EDTA 1.25+EM 100(处理5)>EDTA 6+EM 100(处理6)。当处理组合浓度为EDTA 2.5+EM 100时，其发芽势和发芽率均达到最高，比单独使用EM菌剂、EDTA处理的都要高。而处理6与CK相比，其发芽势和发芽率却显著下降，EDTA浓度达到6 mmol/L时表现出极大的抑制作用。由此可知，EM菌剂与EDTA合理的配合使用非常重要，可有效地促进重金属铜、铅胁迫下黑麦草种子的萌发。

图1 EM菌剂与EDTA配施对铜、铅复合污染下黑麦草种子发芽势和发芽率的影响

2.2 EM菌剂与EDTA配施对铜、铅复合污染下黑麦草幼苗生长的影响

2.2.1 EM菌剂与EDTA配施对铜、铅复合污染下黑麦草种子芽长、根长的影响 由图2可知，不同浓度EM菌剂与EDTA处理对黑麦草芽长和根长的影响大小都表现为处理4>处理3>处理5>处理2>处理1(CK)>处理6的变化趋势。单独使用EM菌剂、EDTA及其配合使用处理与对照(处理1)相比芽长和根长都有明显的提高(处理6除外)。这表明在本试验条件下，EDTA 2.5+EM 100处理组合是黑麦草幼苗生长的最佳浓度。处理4与处理5相比，适当提高EDTA浓度，有利于促进黑麦草的生长，芽长、根长分别为8.34、4.41 cm。但是当EDTA浓度达到6 mmol/L时，芽长、根长则极显著下降，其中芽长、根长分别只有3.09、0.16 cm，表现出明显的抑制作用，且对根的影响大于芽。

图2 EM菌剂与EDTA配施对铜、铅复合污染下黑麦草芽长和根长的影响

2.2.2 EM菌剂与EDTA配施对铜、铅复合污染下黑麦草种子鲜重的影响 由图3可以看出，EDTA 6+EM 100(处理6)对黑麦草的鲜重有抑制作用，且与对照差异极显著。3个EDTA与EM配施处理对鲜重的影响大小表现为EDTA 2.5+EM 100(处理4)>EDTA 1.25+EM 100(处理5)>EDTA 6+EM 100(处理6)的变化趋势。这表明适当增加EDTA浓度可以起到促进作用，但是浓度过高反而抑制黑麦草的生长。其中EDTA 2.5+EM 100处理在所有处理中鲜重达到最大值，与处理6相比，提高了6.2倍，与单独使用的EDTA、EM处理的EDTA 2.5、EM 100相比，鲜重也都有不同程度的提高，说明两者的合理配合使用对鲜重的影响产生了促进效应。

图3 EM菌剂与EDTA配施对铜、铅复合污染下黑麦草鲜重的影响

2.3 EM菌剂与EDTA配施对铜、铅复合污染下黑麦草总酚、类黄酮含量的影响

酚类物质属于具有防御功能的次生物质，能有效清除自由基，提高植物抗逆性。黄春辉等[9]研究指出猕猴桃抗氧化能力与总酚、类黄酮含量呈正相关。硝酸盐胁迫下使用外源黄腐酸类黄酮和可溶性总酚含量增加，缓解对小白菜生长的抑制[10]。

本试验结果表明，不同浓度EDTA与EM处理及其组合对黑麦草总酚、类黄酮含量的影响与对照相比都有不同程度的提高(处理6除外)。其中处理4达到了最高，这与前面幼苗生长和种子萌发表现出基本一致的变化趋势。由此可见，该组合在一定程度上提高了黑麦草抗重金属胁迫的能力，从而促进黑麦草的生长，而处理6中EDTA浓度过高则会产生较强的抑制作用，总酚、类黄酮含量积累也较低，这与前人的研究结论是一致的(表1)。

2.4 EM菌剂与EDTA配施对铜、铅复合污染下铜、铅含量的影响

由表1可知，不同浓度EDTA与EM处理及其组合对黑麦草铜、铅含量的影响达显著(P<0.05)或极显著水平(P<0.01)。处理2与处理1(CK)相比较，使用EM菌剂后铜、铅含量都有不同程度的下降，这说明EM复合菌有利于对环境中重金属的修复。

表1 EM菌剂与EDTA配施对铜、铅复合污染下黑麦草总酚、类黄酮、铅、铜含量的影响

随着EDTA浓度的提高，重金属活化程度提高，结合其生长和种子萌发情况可以看出，EDTA浓度过高，对植物的毒性也随之增大，从而导致植物生长和生物量下降。通过处理4与处理3对比可以看出，EDTA配合EM菌剂使用则使得重金属浓度下降。

综合上述，EDTA与EM合理的配合使用，表现出总酚和类黄酮的积累，提高了黑麦草抗重金属胁迫的能力，从而促进了根系和地上部的生长，为重金属污染的修复奠定了物质基础。

3 讨论

EM复合菌剂在农作物种植业、畜禽饲养业、水产养殖业、环保业等方面都有大量的应用和研究。其中EM应用于土壤重金属修复也有相关报道。如刘瑞伟[11]研究了EM与有机肥对重金属生物有效性，结果表明：施用EM可以达到对低浓度重金属污染土壤进行微生物修复、降低重金属含量、改善油菜品质的目的。采用EM原还能显著改善小麦的长势，提高产量和抗逆性[12]。郑亚南等[13]研究了喷施堆肥复合微生物菌剂条件下草坪植物萌发及生长特性，结果表明：经叶面喷施适当浓度的复合堆肥微生物菌剂，能够显著促进草坪植物的萌发及生长。EM作为一种好氧和嫌氧型微生物制剂，它具有杀虫、除臭、促进植物生长，提高产量和品质，增强抗逆性、降解农残、有机肥无害化等多种功能。建议在茶树上进一步试验应用[14]。由此可知，EM对于重金属修复和提高植物抗逆性都有一定的效果。

在本试验条件下，使用EM菌剂可促进黑麦草芽长、根长增长，提高种子发芽率，与此同时，总酚和类黄酮等抗性物质明显增加，从而减轻重金属胁迫下黑麦草所受的伤害，提高黑麦草的抗逆性，促进根系和地上部分生物量的积累，从而为黑麦草有效吸收溶液中的重金属奠定了物质基础。大量的研究表明，植物的根系和地上生物量的积累是植物吸收重金属的基础[15-16]，这与前人的研究结果是一致的。

EDTA是一种高效的螯合剂，能够有效活化土壤中的重金属，提高植物对重金属的富集量，因此被广泛用于强化植物对土壤中重金属的提取修复[17]，但在EDTA使用浓度上意见不一。张灿灿等[18]研究指出：5 mmol/kg EDTA促进高羊茅生长，浓度超过10 mmol/kg对植物生长产生抑制。廉菲等[19]研究EDTA对一年生黑麦草种子萌发及幼苗生长的影响，建议EDTA参考使用浓度为10 mmol/kg，浓度过高(20 mmol/kg、30 mmol/kg)则会对黑麦草的种子萌发产生极大的抑制作用。由于实际应用条件的不同，各文献报道EDTA的使用浓度并不一致。本试验研究结果表明：低浓度的EDTA能促进种子的萌发和幼苗生长，当EDTA浓度达到6 mmol/L则产生明显的抑制。研究结论总体是相似的，这可能与不同植物处于不同的生长阶段和环境条件等都有密切的关系。

4 结论

(1)EM菌剂对黑麦草的种子萌发、幼苗生长起促进作用，同时使得重金属浓度下降，说明EM菌剂可用于环境中重金属复合污染的修复。

(2)随着EDTA浓度升高，重金属活化程度提高，但是当浓度过高可能抑制黑麦草种子的萌发和幼苗生长，说明在实际应用中应根据实际情况确定EDTA浓度，不同文献报道的推荐使用浓度并不一致，这可能与植物不同生长时期、环境中重金属污染状况等都有密切关系，因此需进一步深入探讨。

(3)本试验结果显示，EM 100倍液+EDTA 2.5 mmol/L处理的效果最佳，与单独施用EM、EDTA相比，对黑麦草生长和种子萌发都有促进作用，而当EDTA浓度达到6 mmol/L时则会产生明显的抑制，因此植物幼苗生长阶段建议EDTA浓度不超过6 mmol/L。

(4)现有的研究大多采用单一微生物进行重金属修复，对于环境中重金属复合污染下植物生长受到毒性的协同作用有极大的限制，故本试验采用了EM复合菌作为供试微生物。另外，鉴于种子萌发阶段幼苗的生物量小，有关EM菌剂与EDTA配施对黑麦草生长、重金属修复的生理机制、重金属的动态变化等有望进一步通过盆栽或田间试验进行深入探讨。包括EM复合菌中能修复重金属有效菌的筛选及其功能特点的研究，以期在基础领域取得更加广阔的应用前景。