弥漫大B细胞淋巴瘤中SAMD9L的表达及意义

缪小兵，何 松，陈卓琳，张邢松，徐小红，周 颖

弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤中最常见的亚型，也是一组异质性疾病，在组织病理学、分子学特征及临床表现方面差异较大[1-3]。SAMD9L位于人类基因组染色体7q21，与其旁系同源SAMD9相邻。现已证实，SAMD9L在调控细胞增殖、肿瘤表型、炎症反应等过程中发挥重要作用[4]。但SAMD9L在淋巴瘤中的表达和作用尚未见报道。本实验采用免疫组化EnVision法检测SAMD9L在DLBCL中的表达及意义，为进一步探索DLBCL的预后提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料收集2013～2018年江苏省南通市肿瘤医院确诊的135例初治非特指型DLBCL患者。135例患者中男性60例，女性75例。年龄11～93岁，中位年龄66岁。结外累及≥2处37例，0～1处98例。Ann Arbor分期：Ⅰ+Ⅱ期49例，Ⅲ+Ⅳ期86例。按Hans分型，生发中心B细胞样(germinal center B-cell-like, GCB)29例，非生发中心B细胞样(non germinal center B-cell-like, non-GCB)106例。有B症状17例，无B症状118例。美国东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG)体能状态(performances status, PS)评分﹤2分18例，≥2分117例。国际预后指数(international prognostic index, IPI)评分≤2分38例，>2分97例。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)正常30例，升高105例。白蛋白(albumin, ALB)正常105例，降低30例。无骨髓浸润88例，有骨髓浸润9例，另有38例无法评估。完全缓解(complete response, CR)或部分缓解(partial response, PR)75例，疾病稳定(stable disease, SD)或进展(progressive disease, PD)35例，另有25例无法评估。

1.2 免疫组化石蜡切片常规脱蜡后，使用EDTA进行抗原修复，冷却至室温后PBS洗涤，一抗4 ℃孵育过夜，PBS冲洗3次，滴加二抗室温孵育1 h，DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。所用一抗为兔抗人SAMD9L多克隆抗体，购自Proteintech公司，稀释比1 ∶100。二抗为Dako REAL EnVision，购自Dako公司。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定SAMD9L定位于细胞质/细胞核，根据阳性细胞着色强度和所占百分比进行评分。按着色强度评分：未着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；按阳性细胞所占百分比评分：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。将两项得分结果相乘：总分1～4分定义为SAMD9L低表达，5～12分定义为SAMD9L高表达。

1.4 统计学分析采用SPSS 23.0软件对数据进行统计学分析，SAMD9L表达与DLBCL临床病理特征之间的关系采用Pearson χ2检验或Fisher精确概率检验。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，单因素和多因素预后分析采用Cox风险比例回归模型。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DLBCL中SAMD9L表达与临床病理特征及治疗反应的相关性SAMD9L主要定位于细胞质，部分病例可观察到细胞核着色。135例DLBCL患者中SAMD9L低表达99例，高表达36例(图1、2)。SAMD9L表达与患者年龄(P=0.049)、B症状(P=0.003)、IPI评分(P=0.026)相关，其在年龄>60岁、有B症状以及高IPI评分患者中表达较高。SAMD9L低表达组和高表达组患者在性别、结外累及、Hans分型、Ann Arbor分期、ECOG PS评分、Ki-67增殖指数、骨髓浸润、LDH水平、ALB水平以及治疗反应方面差异均无显著性(P均>0.05，表1)。

表1 弥漫大B细胞淋巴瘤中SAMD9L表达与临床病理特征及治疗反应的相关性

图1 弥漫大B细胞淋巴瘤中SAMD9L高表达，EnVision法 图2 弥漫大B细胞淋巴瘤中SAMD9L低表达，EnVision法

2.2 SAMD9L表达与DLBCL患者预后的关系至末次随访，SAMD9L低表达组和高表达组分别有38例和28例患者死亡。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，SAMD9L高表达组较低表达组的总生存期(overall survival, OS)缩短(P<0.001，图3)。单因素回归分析显示：年龄(P=0.001)、Ann Arbor分期(P=0.007)、B症状(P<0.001)、ECOG PS评分(P=0.008)、IPI评分(P<0.001)、LDH水平(P=0.001)、ALB水平(P<0.001)、治疗反应(P<0.001)以及SAMD9L表达(P<0.001)是患者预后的影响因素。将单因素分析有统计学意义的因素纳入多因素回归分析，年龄、Ann Arbor分期、ECOG PS评分、LDH水平已包含于IPI评分，不再纳入多因素分析。多因素分析显示：IPI评分(P=0.010)、治疗反应(P<0.001)是独立的预后因素。SAMD9L表达水平是影响OS的相关因素，但非预后的独立影响因素(P=0.710，表2)。

表2 弥漫大B细胞淋巴瘤患者预后的单因素及多因素分析

图3 Kaplan-Meier生存分析SAMD9L表达与

3 讨论

DLBCL是发病率增长较快的恶性肿瘤之一，因其具有高度异质性，给患者的诊断、分型和治疗带来较大困难。目前标准的一线治疗可使约2/3的患者获得长期缓解，但仍有1/3的患者原发耐药或缓解后复发，复发难治性DLBCL患者的中位生存时间约6.3个月[5-7]。因此，深入探索DLBCL的耐药机制，发现有效的预测指标，寻找新的治疗靶点，对于改善复发难治性DLBCL患者的预后具有重要的临床意义。

SAMD9L基因位于人类染色体7q21，并以头到尾的方向与其紧密的旁系同源SAMD9相邻。SAMD9L在人体各类组织中广泛表达。SAMD9L与SAMD9具有约60%的氨基酸同一性，具有保守的功能结构域，包括DNA/RNA结合、蛋白质结合、凋亡小体形成以及NTP水解活性。SAMD9和SAMD9L是儿童骨髓增生异常综合征和一些多系统疾病(如MIRAGE综合征、共济失调症)的易感基因[8]。SAMD9L在细胞增殖、肿瘤表型以及炎症反应中发挥重要作用[4]。Wang等[4]研究发现，SAMD9L在乙肝病毒相关肝细胞肝癌中的表达低于癌旁肝组织，敲低SAMD9L可通过促进细胞周期G1/S期转换促进肿瘤细胞增殖；且敲低SAMD9L可通过活化Wnt/β-catenin信号通路促进肝癌的发生、发展。Li等[9]报道，SAMD9和SAMD9L在肿瘤中的表达水平较低。SAMD9在侵袭性纤维瘤病、乳腺癌和结肠癌中的表达水平低于正常对照组织。SAMD9L在乳腺癌中的表达低于良性乳腺上皮。但SAMD9L在侵袭性纤维瘤病或结肠癌中的表达与正常对照组相比差异无显著性。在血液系统肿瘤中，因7号染色体单体导致的SAMD9L缺失与髓系肿瘤的发生相关[10-11]。通过构建SAMD9L缺陷型小鼠模型，发现其造血干细胞集落形成能力及重构能力增强，对细胞因子更敏感。这种调节生长的作用可能是通过SAMD9L编码的蛋白在核内体促进溶酶体形成，细胞因子受体降解而加速实现的[12]。SAMD9L在淋巴瘤中的表达和作用目前尚未见文献报道。本实验发现，SAMD9L表达与DLBCL患者年龄(P=0.049)、B症状(P=0.003)、IPI评分(P=0.026)相关，其在年龄>60岁、有B症状以及高IPI评分患者中表达较高。但SAMD9L低表达组和高表达组患者在性别、结外累及、Hans分型、Ann Arbor分期、ECOG PS评分、Ki-67增殖指数、骨髓浸润、LDH水平、ALB水平以及治疗反应方面差异均无显著性(P均>0.05)。此外，本实验结果亦发现，SAMD9L高表达组较低表达组的OS显著缩短(P<0.001)。单因素和多因素回归分析显示，SAMD9L表达水平是影响OS的相关因素，但非预后的独立影响因素(P=0.710)。与SAMD9L在其它肿瘤中发挥“抑癌”作用不同，SAMD9L高表达DLBCL患者的预后较差，可能与其所处环境类型不同有关，不同的肿瘤微环境可能导致SAMD9L发挥不同的功能，但其具体机制仍需后续实验深入探究。

综上所述，本实验发现，SAMD9L在患者年龄>60岁、有B症状以及高IPI评分DLBCL患者中表达较高。SAMD9L高表达DLBCL患者较低表达患者的OS显著缩短，SAMD9L表达水平是影响OS的相关因素，但非预后的独立影响因素。