替加环素脂质体的制备工艺研究

徐艳艳，郑丽君，张霞燕，吴振波，朱延焱，王海翔，田吉来

(1.丽水市中心医院，浙江 丽水 323000；2.中国药科大学工学院，江苏 南京 211198；3.南京中医药大学医学院·整合医学学院，江苏 南京 210023)

替加环素(tigecycline)，化学名为((4S,4aS,5aR.12aS)-4,7-双(二甲氨基)-9-[(叔丁基氨基)乙酰氨基]-3,10,12,12a-四羟基-1,11-二氧代-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氢并四苯-2-甲酰胺，是由美国惠氏公司研制的一种具有超广谱抗菌活性的新型甘氨酰环素类抗生素[1-2]，对革兰阴性菌和革兰阳性菌具有广泛抗菌活性，尤其对鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌等具有很好作用[3-4]。替加环素为橘黄色粉末状物质，是一种水溶的弱酸性化合物，logP为1.677 40。替加环素不稳定，其水溶液在空气中易发生氧化降解和差向异构化，加热和搅拌会加速其反应进行，差向异构化后的替加环素不再具有抗菌活性[5-6]。替加环素需要被保存在-60 ℃中。另外目前市面上替加环素以冻干粉针剂为主要剂型，存在靶向性不强、无法通过血脑屏障等缺点，在治疗颅内感染时疗效较差。

提高药物稳定性一般有环糊精包埋、PEG分子修饰、平衡离子成盐、药物分子框架技术、做成其他载药体系(如微囊、脂质体、胶束等)等方法[1]。其中，脂质体是在20世纪60年代发现的一种具有脂质双分子层的超微球形载体制剂。脂质体可以将药物包裹在内水相或者脂层，防止药物受外界环境影响而降解。除此之外，它还具有如下特点:①通过修饰脂质体表层可以达到靶向治疗作用；②修饰后可以避免被网状内皮系统清除，提高药物利用度，减少药物剂量，提高药效、降低不良反应等；③生物相容性良好，易于通过生物屏障(血脑屏障、肺部黏液屏障等)；④抵抗对药物的耐药性等[2]。因此，为了提高替加环素的稳定性，改善替加环素的生物利用度，本研究拟制备替加环素脂质体，采用离心法进行包封率测定，并采用响应面法进行制备工艺优化。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 ATX224型电子天平(株式会社岛津制作所)；RE-5205型旋转蒸器(上海亚荣生化仪器厂)；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；HH-42型数显恒温搅拌循环水箱(常州国华电器有限公司)；PHS-3C型pH计(上海精密科学仪器有限公司)；LC-15C型高效液相色谱仪[岛津企业管理(中国)有限公司]；TGL-16G型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；KH-100B型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)。

1.2 试药 替加环素标准品(含量99%，批号：291641，北京百灵威科技有限公司)；大豆卵磷脂(食品级，江苏源盛通生物工程有限公司)；胆固醇(批号：20181128，国药集团化学试剂有限公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，上海星可高纯溶剂有限公司)；无水乙醇(分析纯，上海泰坦科技股份有限公司)；二氯甲烷(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)。

2 方法

2.1 替加环素脂质体的制备 精密称取10 mg替加环素和适量的胆固醇和大豆磷脂于500 mL圆底烧瓶中，加入二氯甲烷溶解，置旋转蒸发仪上减压蒸发制得磷脂膜，加入pH为7.2的PBS缓冲液50 mL，水浴加热30 min后超声分散5 min，得到均一的黄色溶液，吸取适量溶液过0.45 μm水系微孔滤膜，得到替加环素脂质体，在4 ℃冰箱中保存[9]。

2.2 脂质体中替加环素含量测定方法的建立

2.2.1 色谱条件 色谱柱：UItimate XB-C18(4.5 mm×150 mm，3 μm)，柱温：室温25 ℃，流动相：PBS-EDTA缓冲液∶乙腈=75∶25，流速：1.0 mL·min-1，检测波长：248 nm。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取5 mg替加环素标准品，用“2.2.1”项下流动相配制成0.2 mg·mL-1替加环素储备液，吸取一定量替加环素储备液，以流动相作为溶剂梯度稀释获得浓度为100、80、40、20、10 μg·mL-1对照品溶液。

2.2.3 线性范围考察 对照品溶液按“2.2.1”项下的色谱柱条件进行HPLC测定，以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X(μg·mL-1)为横坐标进行线性回归，得到方程为Y=50 526X-107 253，R2为0.999，线性范围为10～100 μg·mL-1。

2.3 建立替加环素脂质体包封率测定方法 将制备好的替加环素脂质体溶液高速离心(15 000 r·min-1、15 min)，取上层清液，过0.22 μm的水系滤膜，用高效液相色谱仪检测。按如下计算公式计算脂质体包封率(EE)和载药量，评价替加环素脂质体的质量，另设综合评分指标直观评估替加环素脂质体的制备工艺。

包封率(%)=(总替加环素-游离的替加环素)/总替加环素×100%

载药量(%)=(总替加环素-游离的替加环素)/磷脂用量×100%

综合评分(%)=包封率×50%+载药量×50%

3 结果

3.1 单因素试验 固定二氯甲烷体积和大豆磷脂用量，对替加环素脂质体制备过程中的水化温度、药脂比、胆脂比这3个因素进行单因素考察。以高速离心法联合高效液相色谱法测定替加环素脂质体的包封率。

3.1.1 对水化温度的考察 固定药脂比为1∶20，胆脂比为1∶5，设置水化温度分别是30、40、50、60、70 ℃，按上述方法制备替加环素脂质体并测定其包封率及载药量，如图1所示。

图1 不同水化温度对替加环素脂质体品质的影响

结果显示，其他参数条件不变时，70 ℃水化温度下制备的替加环素脂质体的包封率和载药量都最高，但在放置4 d后该试验所得的所有替加环素脂质体受不同水化温度影响而呈现不同程度的颜色变化，且越高的水化温度其颜色变化越深。考虑到替加环素在高温中不稳定易变质，因此弃用70 ℃水化温度，改用包封率、载药量次之的60 ℃的水化温度。

3.1.2 对替加环素和总脂质量比的考察 固定水化温度为60 ℃，胆脂比为1∶5，设置药脂比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，按上述方法制备替加环素脂质体并测定其包封率及载药量，如图2所示。

图2 不同药脂比对替加环素脂质体品质的影响

结果显示，随着药脂比的增大，包封率依次增大，而载药量依次降低。而在综合评分上，当药脂比为1∶30时，数值最大。

3.1.3 对胆固醇和大豆磷脂质量比的考察 固定水化温度为60 ℃，药脂比为1∶20，设置胆脂比分别为1∶2、1∶4、1∶5、1∶6、1∶8，按上述方法制备替加环素脂质体并测定其包封率及载药量，如图3所示。

图3 不同胆脂比对替加环素脂质体品质的影响

结果显示，当胆脂比是1∶6时，替加环素脂质体的包封率和综合评分都达到了最高，而载药量最高的胆脂比则是1∶5。综合考虑，当胆脂比为1∶6时，制得的替加环素脂质体的品质最优。

3.2 响应曲面法优化处方 根据单因素考查、正交试验以及Box-Benhnken中心组合试验设计的原理，确定主要影响制备的因素为水化温度(A)、药脂比(B)、胆固醇与大豆磷脂质量比(C)，以替加环素脂质体的包封率、载药量和综合评分为响应值，每个因素设 3个水平，进行响应曲面试验[10]。响应面试验的因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验的因素与水平设计表

响应面试验结果见表2。

表2 响应面法试验结果

3.2.1 以包封率为响应值观察 利用Design-Expert 软件进行拟合分析，结果显示(见表3和图4)，包封率与A、B、C 呈显著线性关系(P<0.01)。得到模型的拟合曲线方程为包封率=56.77+2.28×A+9.33×B+9.4×C，即包封率=56.772 94+2.277 5×温度+9.332 5×药脂比+9.4×胆脂比。

表3 包封率的响应面方差分析表

模型F值为16.57意味着模型是显著的。“Prob>F”值小于0.050 0表示模型项是显著的。在这种情况下，B、C是重要的模型项。大于0.100 0的值表示模型项不重要。该模型的失拟项P>0.1，不显著，试验误差较小，因此可用此模型对替加环素脂质体制备工艺进行分析和预测。

A.温度对包封率的影响效果图；B.药脂比对包封率的影响效果图；C.胆脂比对包封率的影响效果图图4 单因素对包封率的影响效果图

替加环素脂质体制备工艺中影响包封率的主次因素顺序为C>B>A，即胆脂比的影响最大，药脂比次之，水化温度的影响最小。以包封率为指标，最佳处方工艺为A1B1C0，即水化温度为60 ℃，药脂比为1∶30，胆脂比为1∶5。

3.2.2 以载药量为响应值观察 利用Design-Expert 软件进行多元回归拟合分析，结果显示(见表4和图5)模型的拟合曲线方程为载药量=3.56+0.25×A-1.54×B+0.24×C-0.27×A×B+0.098 ×A×C-0.8×B×C-0.31×A2+1.02×B2+0.18×C2，即载药量=3.556+0.247 5×温度-1.536 25×药脂比+0.238 75×胆脂比-0.267 5×温度×药脂比+0.097 5×温度×胆脂比-0.805×药脂比×胆脂比-0.305 5×温度2+1.022×药脂比2+0.177×胆脂比2。

模型F值为32.65意味着模型是显著的。“Prob>F”值小于0.050 0表示模型项是显著的。在本例中，B、BC、B2是重要的模型项。大于0.100 0的值表示模型项不重要。该模型的失拟项不显著，因此可用此模型对替加环素脂质体制备工艺进行分析和预测。

表4 载药量的响应面方差分析表

A.温度与药脂比对载药量的影响效果图；B.温度与胆脂比对载药量的影响效果图；C.胆脂比与药脂比对载药量的影响效果图图5 不同因素对载药量的影响效果图

在温度与药脂比的交互作用效果图中可知，药脂比的等高线分布较温度的等高线分度密集，且响应面3D图形在药脂比维度上的坡度变化较大。因此认为在替加环素脂质体的制备工艺中，温度的影响更为显著，这一结论与表4中的因素显著性结果一致。

根据载药量由Design Expert软件获得的最佳处方工艺为A1B1C0，即水化温度为60 ℃，药脂比为1∶30，胆脂比为1∶5。

3.2.3 以综合评分为响应值观察 根据Design-Expert 软件进行拟合分析，结果显示(见表5和图6)，包封率与A，B，C 呈显著线性关系(P<0.01)。得到模型的拟合曲线方程为综合评分=30.37+1.26×A+3.9×B+4.82×C，即综合评分=30.374 71+1.262 5×温度+3.898 12×药脂比+4.819 38×胆脂比。各因素影响效果见图6。

A.温度对综合评分的影响效果图；B.药脂比对综合评分的影响效果图；C.胆脂比对综合评分的影响效果图图6 不同因素对综合评分的影响效果图

模型F值为12.16意味着模型是显著的。“Prob>F”值小于0.050 0表示模型项是显著的。在这种情况下，B、C是重要的模型项。大于0.100 0的值表示模型项不重要。该模型的失拟项不显著[8]，因此可用此模型对替加环素脂质体制备工艺进行分析和预测。

表5 综合评分的响应面方差分析表

替加环素脂质体制备工艺中影响综合评分的主次因素顺序为C>B>A，即胆脂比的影响最大，药脂比次之，水化温度的影响最小。以综合评分为指标，最佳处方工艺为 A1B1C0，即水化温度为60 ℃，药脂比为1∶30，胆脂比为1∶5。

4 讨论与结论

制备脂质体过程中，胆固醇作为膜的流动性调节剂，大豆磷脂和胆固醇比例的变化对膜的形成有关键影响；成膜后加入水化液在一定温度下可形成脂质体。包封率和载药量是评价脂质体制备工艺和质量的重要指标，包封率反映了药物被载体包封的程度，包封率越高，药物被利用的程度越高，成本越低；载药量的大小直接影响到药物的临床应用剂量，故载药量愈大，愈易满足临床需要。因此，本实验以包封率和载药量为响应值，通过单因素试验考察了水化温度、药脂比、胆脂比等因素对制备工艺的影响，通过响应面试验优化了脂质体的制备工艺，得到了替加环素脂质体的最优工艺为水化温度60 ℃、药脂比为1∶30、胆脂比为1∶5，在此条件下制备的替加环素脂质体的包封率为73.07%，载药量为3.00%，综合评分为38.03%。