沙棘油中脂肪酸的GC-MS分析及其抗炎机制的网络药理学研究

郑苏楠，程春雷，王永刚*

(1.中山大学生命科学学院，广东省中药上市后质量与药效再评价工程技术研究中心，广东 广州 510275；2.山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101)

沙棘作为一种药食同源作物，广泛分布于我国西部干旱、半干旱以及高寒地区，不仅用于生产多种保健食品、饮品，也常用于治疗各种疾病。沙棘果中油脂含量丰富，可达到约20%[1]。沙棘油是从天然植物沙棘的果实中提取的天然肉脂，是用途最广泛的天然油之一，富含类胡萝卜素、生育酚、omega-3和omega-6脂肪酸以及植物甾醇等生物活性物质[2]。这些活性物质不仅具有很高的抗氧化活性，也可以降低高脂喂养兔子血浆中的总胆固醇含量，具有抗动脉粥样硬化潜力[3]。多项研究表明，沙棘油包含的棕榈油酸和亚麻酸等[4]，具有促进皮肤再生，改善血液循环，防止感染，预防过敏，抑制衰老等作用，还可以调节肠道菌群[5]。同时沙棘油还具有明显的抗炎镇痛、化腐生肌和扶正固本作用，对于放射性皮炎、黏膜炎,以及烧伤、烫伤、褥疮、皮肤溃疡、子宫糜烂等非放射性炎症均有显著疗效[6]。其物质基础及作用机制尚不清楚，本研究通过对沙棘油进行气相色谱-质谱联用(GC-MS)法分析，基于网络药理学方法，对沙棘油的主要脂肪酸成分及抗炎作用靶点、通路进行系统分析，以期为后续研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料 胡颓子科沙棘属沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)果干，产地宁夏。

1.2 实验方法

1.2.1 沙棘油脂肪酸种类测定 将沙棘果干粉碎过筛后，以石油醚(沸程60～90 ℃)为溶剂，在80 ℃下索氏提取8 h后回收石油醚，即得沙棘油样品。将沙棘油样品在碱性条件下甲酯化，采用气相色谱-质谱联用法进行测定[7]。

样品配制：将6.55 g氢氧化钾溶于50 mL无水甲醇中，加入无水硫酸钠干燥，过滤后得2 mol·L-1氢氧化钾-甲醇溶液备用。称取50 mg沙棘油样品，加入10 mL正己烷振摇2 min，再加入2 mol·L-1氢氧化钾-甲醇溶液5 mL快速混匀，振摇1 min，静置5 min，取上清液待测。

色谱条件：色谱柱TR-FAME(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)；载气He，流量1 mL·min-1；进样量为0.3 μL，分流进样，分流10∶1；进样口温度250 ℃，初始温度为60 ℃，保持3 min，以5 ℃·min-1升至160 ℃，以2 ℃·min-1升至220 ℃，以10 ℃·min-1升至250 ℃；接口温度280 ℃。

质谱条件：电子轰击(EI)离子源；离子源温度230 ℃，电离能70 eV；倍增器电压800 V；采用Q1 MS 扫描模式，扫描质量范围35 ～ 550 amu。标准谱库为NIST 2.3谱库(美国国家科学技术研究所)。

1.2.2 沙棘油活性成分作用靶点筛选 通过TCMSP数据库检索候选化合物作用靶点，并通过UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)将其蛋白名称转化为相应的基因名称。同时通过Swiss TargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)进行沙棘油活性成分作用靶点筛选，以Probability>0为筛选标准，预测作用靶点。将上述2个数据库平台筛选得到的作用靶点进行合并、去重，即为沙棘油活性成分的作用靶点。

1.2.3 疾病靶点收集汇总 以Inflammation为关键词，在DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org/)中检索抗炎的潜在靶点，Score值越高就表明此靶点与清热抗炎的联系越紧密，选取Score≥0.1的靶点作为抗炎作用潜在靶点，整理得到炎症对应的疾病靶点。

1.2.4 构建药物成分-靶点-疾病靶点网络 将沙棘油活性成分对应靶点及其炎症相关的潜在作用靶点导入Cytoscape软件，构建沙棘油抗炎作用的“药物成分-靶点-疾病靶点”网络并利用Cytoscape自带的分析功能模块“Networkanalysis”进行网络属性分析。节点(Node)代表成分、靶点以及通路，边(Edge)代表它们之间的联系。

1.2.5 构建沙棘油活性成分-抗炎靶点PPI网络 将筛选得到的沙棘油活性成分靶点与炎症相关靶点取交集，并利用在线网站Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)绘制Venn图。所得靶点交集即为沙棘油抗炎潜在靶点，将所得靶点交集输入STRING数据库(https://string-db.org/)，选择Multiple proteins之后将物种设置为Homo sapiens，其余设置默认，得到蛋白质相互作用(PPI)网络。

1.2.6 GO富集分析和KEGG通路分析 利用DAVID数据库对潜在作用靶点进行GO(Gene ontology)富集分析，并通过KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析探寻沙棘油抗炎作用生物功能以及主要信号通路分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 沙棘油脂肪酸成分 沙棘果油GC-MS色谱图见图1，检测到的脂肪酸种类如表1所示。结果表明，沙棘果油中含有丰富的棕榈油酸、棕榈酸、油酸、亚油酸和亚麻酸等，测量结果与文献报道相近[8-9]。

图1 沙棘果油脂肪酸甲酯GC-MS总离子流图

表1 沙棘油中脂肪酸种类测定结果

2.2 沙棘油脂肪酸的作用靶点及炎症对应靶点 将所得到的沙棘油中8个成分通过TCMSP数据库进行检索，同时基于Swiss TargetPrediction数据库平台进行预测，使用UniProt数据库收集作用靶点的基因名(gene name)，删除重复或者无效靶点，共获得沙棘油脂肪酸成分的作用靶点208个。在DisGeNET数据库中检索筛选得到炎症相关作用靶点共175个。

2.3 沙棘油抗炎的“成分-靶点-疾病”网络 将筛选得到的成分靶点导入Cytoscape，建立沙棘油抗炎的“成分-靶点-疾病”网络。结果如图2所示，共有372个节点，918条边。

图2 沙棘油抗炎作用的“成分-靶点-疾病”网络

2.4 沙棘油活性成分-抗炎靶点PPI网络 将沙棘油脂肪酸作用靶点与炎症相关靶点取交集，结果如图3所示，得到PTGS2、PIK3CG、PPARA、NR1H4、SLC22A5、PTPN1、PPARG、PTGER4、ABCB1、PLA2G4A、PTGES、ALOX5、RORC、LTB4R、NOS2、TRPV1、IL6、ALOX5AP、TRPA1共19个交集靶点，即为沙棘油抗炎的潜在作用靶点。

图3 沙棘油抗炎的潜在作用靶点

PPI网络如图4所示，共有19个节点，48条边，有1个潜在靶点未参与蛋白相互作用。该网络节点平均连接度为5.05。

2.5 GO富集分析和KEGG通路分析结果 将19个交集靶点基因上传到David在线数据库进行GO富集分析以及KEGG分析，得到具有统计学意义(P<0.05)的GO条目共88条，富集得到15条相关通路。GO条目中生物学进程(biological process，BP)共67条，细胞组分(cellular component，CC)共5条，分子功能(molecular function，MF)共16条。靶点基因主要参与细胞或亚细胞成分的运动、蛋白激酶B信号的正调控、伤口愈合、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控等生物学进程，对应质膜、胞质溶胶、内质网膜等细胞组分以及蛋白质结合、药物结合、离子通道活性等分子功能，R语言可视化结果如图5所示。

图4 沙棘油抗炎的靶蛋白PPI网络

图5 GO分析结果图

此外，KEGG通路分析结果显示的相关通路有酒精性脂肪肝、癌症通路、TNF信号通路等，具体结果见表2，R语言可视化结果如图6所示。

3 讨论

沙棘油作为沙棘的主要活性成分，具有显著抗炎效果，但沙棘油抗炎的作用机制尚不明确。本研究利用网络药理学方法，从沙棘油活性成分、作用靶点以及相关通路等方面对于沙棘油的抗炎机制进行分析与讨论。沙棘油中主要活性成分为脂肪酸类物质含有大量不饱和脂肪酸。其中棕榈油酸可降低白介素6(IL-6)基因以及过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)基因的表达，抑制NF-κB通路，从而起到降低炎症因子的表达，达到抗炎目的[10-11]。研究表明，特殊促愈合介质(specialized pro-resolving mediators，SPMs)是一类具有特殊抗炎作用的生物活性分子，可能是多不饱和脂肪酸的抗炎基础[12]。

在沙棘油抗炎的蛋白相互作用网络中，核心靶点为IL-6、PTGS2、ALOX5、PTGEP4等。其中IL-6是一种多功能炎性细胞因子，是炎性介质网络的关键成分，在呼吸系统、循环系统及消化系统等炎症反应中起重要作用[13-14]。PTGS2的治疗可通过降低血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平及其mRNA表达来减轻类风湿关节炎大鼠的炎症。ALOX5是脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)家族基因的一员，ALOX5编码的5-LOX可催化炎症介质白细胞三烯(leukotriene，LT)和脂氧素(lipoxins，LX)生成[15]。

表2 KEGG通路分析结果

图6 KEGG富集分析气泡图

通过KEGG信号通路气泡图的颜色和大小可以得出，沙棘油抗炎的主要通路有癌症通路、非酒精性脂肪肝(NAFLD)等。NAFLD本身就是一种低浓度的全身性炎症反应，炎症因子会参与疾病的进展。脂质在肝细胞中沉积，免疫细胞激活，促炎因子释放，引起脂肪变性，而脂肪变性促进炎症的产生，炎症反过来促进单纯肝脂肪变性向非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)进展[16-17]。炎症因子与癌症也密切相关，可以作用于肿瘤的发生、恶性转化及转移等疾病进程。NF-κB信号转导作为炎症的一个整体启动子，在炎症和肿瘤之间起到重要作用[18]。

综上所述，本研究通过网络药理学方法，构建出“沙棘油-靶点-炎症”网络模型，对沙棘油抗炎机制进行了初步预测，分析了沙棘油抗炎相关靶点及信号通路。基于上述研究，可以发现沙棘油通过多成分多靶点对炎症反应进行调控，为后续研究提供了指导意义。