固相萃取-高效液相色谱法测定地表水中的微囊藻毒素-LR 的方法优化

刘 畅

(辽宁省生态环境监测中心，辽宁 沈阳 110161)

引言

微囊藻毒素(Microcystins,MC) 是由蓝藻水华等爆发所产生的一种单环七肽物质,具有明显的肝细胞毒性。结构中存在着环状结构和间隔双键,因而具有相当的稳定性。能够抑制蛋白磷酸酶活性,是强烈的肝脏肿瘤促进剂。随着有关微囊藻毒素毒性的不断深入研究,还发现其具有多器官毒性、遗传毒性、神经毒性、免疫毒性和潜在的促癌性,并能引起受试生物发育异常。中国水体的富营养化程度逐渐加剧,蓝藻水华和赤潮的发生逐渐增加,80%的蓝藻水华均可检测出次生代谢产物——微囊藻毒素,其对水体环境和人群健康的危害已成为全球关注的重大环境问题之一[1]。

微囊藻毒素由于多肽中2 种可变氨基酸组成的不同,具有多种异构体。其中,存在最普遍、含量最多的是微囊藻毒素-LR、微囊藻毒素-RR、微囊藻毒素-YR (L、R、Y 分别代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸)。MC 的毒性与其结构相关,研究表明,微囊藻毒素-LR 的急性毒性最强,微囊藻毒素-YR 次之,微囊藻毒素-RR 最弱[2]。《地表水环境质量标准》 (GB 3838-2002)、《生活饮用水卫生标准》 (GB 5749-2006)的颁布,将微囊藻毒素-LR 确定为监测指标,标准限值确定为1μg·L-1,因此,对地表水中微囊藻毒素-LR 测定方法的优化及改进是很有必要的,改进后,方法简单、灵敏度较高,适合生活饮用水及其水源中微囊藻毒素-LR 的日常检测。

1 材料与方法

1.1 适用范围

本方法规定用液相色谱法测定生活饮用水及其水源中的微囊藻毒素-LR。本方法适用于生活饮用水及其水源中微囊藻毒素-LR 的测定。本方法检出限为微囊藻毒素-LR 0.01μg·L-1。

1.2 原理

采用固相萃取技术富集水中微囊藻毒素-LR,洗脱液浓缩后,用具有紫外检测器的高效液相色谱仪进行分离检测。

1.3 试剂及药品

配置标准样品和样品分析的试剂和材料:所使用的试剂除另有规定外均为色谱纯。

1.3.1 甲醇

每批甲醇都要进行空白检验。

1.3.2 去离子水

超纯水仪制备,满足电阻率≥18.2MΩ·cm-1,TOC＜5μg·L-1。

1.3.3 三氟乙酸

HPLC 专用,纯度不低于99.5%。

1.3.4 标准样品

微囊藻毒素-LR 标准样品(500μg),置于-20℃冰箱中避光保存。

1.3.5 微囊藻毒素-LR 标准储备溶液

将500μg 微囊藻毒素-LR 标准样品溶于1.0mL 甲醇(1.3.1) 中,作为500mg·L-1储备液,置于-20℃冰箱中避光保存。

1.3.6 液相色谱分析用标准中间溶液

取适量标准储备溶液(1.3.5) 用甲醇(1.3.1)稀释配制到一定浓度。

1.3.7 固相萃取柱

HLB 固相萃取柱(200mg,6mL) 或其它等效固相萃取柱。

1.4 仪器设备及器皿

高效液相色谱仪,配有二极管阵列检测器；色谱柱:ODSC18柱 (4.6mm×250mm,5μm)；固相萃取仪；自动浓缩仪。

1.5 样品的采集及保存

用玻璃容器采集水样,从采集到萃取前,必须将样品在4℃下冷藏避光保存,并在7d 内对样品进行萃取,萃取后40d 内分析完毕。用采水器取5L 水样,立即加乙酸至样品体积的5%进行固定,置于-20℃冰箱中避光存放。

1.6 分析步骤

1.6.1 样品前处理

取水样5L,经0.45μm 滤膜减压过滤。滤液加入0.5%甲醇混合后过HLB 固相萃取柱。固相萃取柱使用之前以10mL 甲醇及10mL 去离子水活化。将水样以5～10mL·min-1的流速流过固相萃取柱进行富集浓缩。上样完成后,用20%甲醇水溶液10mL 淋洗以净化样品,用氮气吹干固相萃取柱后,用10mL 甲醇(含0.1%的三氟乙酸) 以1mL·min-1的流速将固相萃取柱中的微囊藻毒素洗脱,洗脱液收集于浓缩瓶内。另外,用20mL 甲醇(含0.1%的三氟乙酸) 浸泡水样过滤滤膜,超声萃取15min,以提取藻细胞中的微囊藻毒素-LR,将滤膜提取液与水样洗脱液合并于浓缩瓶中。将合并后的提取液氮吹浓缩至1.0mL 定容,经针式过滤器过滤保存,待上机分析。

水样中的微囊藻毒素-LR 含量应为水体中和藻细胞中微囊藻毒素-LR 含量之和,所以,在提取水样中微囊藻毒素-LR 进行富集洗脱的同时,要提取藻细胞中的微囊藻毒素-LR,进而确保水样中微囊藻毒素-LR 的全面检测。

1.6.2 液相色谱分析条件(推荐)

色谱柱:ODS C18柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相:甲醇∶水(含0.1%的三氟乙酸)=60：40(V/V)；流速:0.8mL·min-1,等速洗脱；进样体积:10μL；色谱柱温:30℃；检测器:配有二极管阵列检测器,测定波长238nm；保留时间、特征吸收谱图定性,外标法峰面积定量。

1.6.3 标准曲线的绘制

用甲醇将500mg·L-1的标准储备液逐级稀释,配制成0.2mg·L-1、0.5mg·L-1、1.0mg·L-1、2.0mg·L-1、5.0mg·L-1和10.0mg·L-1的系列浓度标准使用液。在推荐的液相色谱分析条件下,对系列标准溶液进行测定,由低浓度到高浓度依次进样,以微囊藻毒素-LR 含量(mg·L-1) 对峰面积(μV·s) 绘制标准曲线,回归方程线性良好,相关系数为0.999。

1.7 精密度和准确度

分别取质量浓度为1.0mg·L-1、2.0mg·L-1、5.0mg·L-1和10.0mg·L-1的微囊藻毒素-LR 溶液进行平行测定,其相对标准偏差为2.9%～8.9%。添加以上浓度水平的水样进行回收率实验,回收率为74.7%～94.6%[3]。

2 结果与讨论

2.1 固相萃取柱及洗脱溶液用量的选择

目前固相萃取主要采用C18、HLB 固相萃取柱,分别对2 种固相萃取柱的生活饮用水中微囊藻毒素-LR 富集、净化效果进行了考察,C18 柱回收率变化较大,检测稳定性一般,HLB 柱对微囊藻毒素-LR 有较好的富集效果,回收率稳定,检测可重复性良好,因此,采用HLB 固相萃取柱,规格为200mg、6mL。关于洗脱过程甲醇用量的确定,分别采用6mL、8mL、10mL、12mL 甲醇溶液进行洗脱,实验表明,10mL 甲醇可将微囊藻毒素-LR 充分洗脱。向甲醇中加入0.1%的三氟乙酸,洗脱效果显著提升,因此,最终选择10mL 甲醇(含0.1%三氟乙酸)[4]。

2.2 流动相及流速的选择

流动相组分和流速的选择会影响色谱峰的出峰时间和对称性,同时也会影响到基线的波动,本文选用了固定配比的甲醇和水(含0.1%三氟乙酸) 作为流动相,在选定流速下考察对微囊藻毒素-LR 的色谱行为。

结果表明,随着甲醇比例的增大,待测化合物的保留时间缩短,并且峰形渐好。但是当甲醇比例增加到90% (体积比) 时,待测物出峰较早,对于多种微囊藻毒素的同时测定,则会表现为出峰时间间隔过短。综合考虑出峰时间以及峰形优化,最后选择流动相配比为甲醇∶水 (含0.1%三氟乙酸)=60：40(V/V)。

此外,本文也在选定流动相配比的情况下,考察了流速变化对测定微囊藻毒素-LR 的影响。结果表明,随着流速的增大,出峰时间明显缩短；当流速为0.5mL·min-1时,完成测定需要32min；当流速为0.8mL·min-1时,完成测定需要20min；当流速为1.0mL·min-1时,完成测定需要16min。但是考虑到流速为1.0mL·min-1时,多种微囊藻毒素的同时测定时色谱峰间隔过短,并且试剂用量较大,选择流动相流速为0.8mL·min-1,利于今后将方法拓展为多种微囊藻毒素的同步检测[5]。

3 注意事项

样品采集、分析过程做好质量把控和质量保证工作,以保证测试数据的准确性；从采集到萃取前,必须将样品在4℃下冷藏避光保存,尽快分析[6]；萃取液浓缩时,氮吹至1.0mL 以下后应立即停止,定容,否则待测物会有较大损失；微囊藻毒素-LR 标准储备液要尽快使用,防止降解影响测试的准确性,于-20℃冰箱内保存,有效期2 个月[7]；微囊藻毒素具有明显的肝毒性,在实验过程应最大程度避免任何试剂或标样溶液沾染皮肤,储备液、系列浓度标样等配置一定要在通风橱中操作[8]。

4 结语

本文尝试对固相萃取-高效液相色谱法测定地表水中的微囊藻毒素-LR 的方法进行优化,固相萃取选择HLB 固相萃取柱,通过实验发现,在洗脱液甲醇中加入0.1%的三氟乙酸,洗脱效果显著提升,最终选择甲醇(含0.1%三氟乙酸) 作为固相萃取的洗脱溶液；流动相随着甲醇比例的增大,待测化合物的保留时间缩短,并且峰形渐好,确定最佳流动相配比为甲醇∶水(含0.1%三氟乙酸)=60：40 (V/V)；综合考虑方法的拓展性,测定多种微囊藻毒素的出峰间隔和试剂成本,确定最佳流动相流速为0.8mL·min-1。改良后,方法操作简单、灵敏度较高,具有较好的精密度和准确度,能很好地满足生活饮用水及其水源中微囊藻毒素-LR 的日常检测要求。