Caspase家族与心血管疾病及中药复方的干预研究❋

杨 光，何浩强,2，周思远，王 阶

(1.中国中医科学院广安门医院，北京 100053；2.北京中医药大学，北京 100029)

近年来，心血管疾病的残余风险使降脂联合抗炎的治疗策略备受关注[1]。随着卡纳单抗、MCC950为代表的靶向抗炎药物取得突破性进展，人们开始探索更为有效的干预靶点。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)是固有免疫与细胞凋亡多条信号通路中的“关键元件”。既往关于Caspases的认识主要集中在调控细胞凋亡方面，近年来人们发现，Caspases还可介导细胞焦亡引起的炎症反应，广泛参与动脉粥样硬化等心血管疾病的发生发展。另一方面，Caspases调控细胞凋亡的理论也日渐丰富。该文检索国内外文献，阐述Caspases的科学内涵及其与心血管疾病的联系，并对近5年中药复方针对Caspases干预心血管疾病的研究报道进行述评。

1 Caspase家族简述

Caspase是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶的简称，能特异性地切割靶蛋白的天冬氨酸残基的肽键。Caspases一般以酶原(pro-Caspase)的形式存在于细胞质中，pro-Caspases与反应物特异性结合后，可通过自体切割的形式释放有生物活性的Caspases。成熟Caspases也可由其他Caspases活化产生。Caspase家族共有14个成员，根据其生物学功能，可分为炎症Caspases、凋亡Caspases及其他功能不明确的Caspases[2]。炎症Caspases指Caspase-1/4/5/11，介导细胞焦亡发生。凋亡Caspases包括凋亡起始Caspases与凋亡效应Caspases。起始Caspases包括Caspase-8/9/10，效应Caspases包括Caspase-3/6/7，但其分类目前仍没有定论。炎症Caspases一般含有CARD结构域，是募集炎症小体的必要结构。凋亡起始Caspases含有DED结构域，是组装死亡信号复合体的结构之一。Caspases分子间的相互激活及参与的信号传导通路(图1)。

图1 Caspases参与细胞凋亡与细胞焦亡的作用通路

1.1 Caspase-1介导经典细胞焦亡途径

细胞焦亡是一类坏死性和炎症性的细胞程序性死亡，最主要的特征是穿孔素(Gasdermin D,GSDMD)在细胞膜表面形成“孔道”引起大量胞内容物的外流(如炎性因子等)，导致细胞的渗透性溶解及炎症反应的扩大[3]。根据启动元件——炎症小体的不同，细胞焦亡可分为依赖Caspase-1的经典途径和依赖Caspase-4/5/11的非经典途径2种方式。

炎症小体是免疫细胞内多种蛋白质组成的复合体，存在于细胞质中，一般由3个部分组成，如受体蛋白、衔接蛋白以及效应蛋白。炎症小体的名称一般以其受体部分的名称代指。NOD样受体蛋白3(nod-like receptor pyrin domain3,NLRP3)、黑色素瘤缺乏因子2(Absent in melanoma 2,AIM2)等受体在接收到配体的信号后，通过PYD或CARD结构域募集衔接蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)，形成的二聚体通过自身的CARD结构域与pro-Caspase-1的CARD结构域结合形成炎症小体。炎症小体被激活后通过自身剪切产生效应蛋白Caspase-1[3]。NLRP3是研究最多的炎症小体，可被多种病原相关分子模式或损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMPs)激活，在固有免疫系统中发挥了重要作用[4]。Caspase-1形成后一方面裂解GSDMD产生其氨基端肽段。GSDMD-N插入细胞膜中形成20 nm左右的小孔，破坏细胞膜的完整性引发细胞焦亡[5]；另一方面Caspase-1剪切白细胞介素(interleukin，IL)的前体，形成活化的IL-1β和IL-18。IL-1β和IL-18诱导一系列细胞因子和趋化因子产生，进一步募集炎症细胞，扩大炎症反应。

1.2 Caspase-4/5/11介导非经典细胞焦亡途径

非经典炎症小体可看作是经典炎症小体的补充，因其能绕过Toll样受体(toll-like receptors,TLR)4、Nod样受体及Caspase-1参与细胞焦亡而得名[6]。非经典炎症小体以Caspase-4/5/11为核心，不需要衔接蛋白，本身即可对各种细菌作出免疫应答，甚至被认为是一种新的模式识别受体[7]。目前关于Caspase-11的研究较深入，其在应答细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)时有两种激活模式。细胞外的LPS活化TLR4，通过β干扰素TIR结构域衔接蛋白、1型干扰素等信号通路促进pro-Caspase-11表达，进而释放活性Caspase-11[8，9]；细胞内形成囊泡的LPS直接被Caspase-11识别，通过两者共有的CARD结构域诱导Caspase-11产生活性。Caspase-11也能特异性剪切GSDMD，产生GSDMD-N，故可引发细胞焦亡。另有研究认为，Caspase-11通过促进K+外流，参与NLRP3炎症小体的组装，导致细胞焦亡反应进一步扩大[10]。

1.3 Caspase-8/10参与外源性细胞凋亡途径

细胞凋亡不同于细胞焦亡，是机体清除衰老、损伤细胞，维持稳态的重要机制，但某些情况下凋亡也会导致继发性的病理损害。细胞凋亡包括3种信号传导途径，如死亡受体介导的细胞外途径、线粒体介导的细胞内途径和内质网应激途径。

在细胞外，机体给细胞下达的“死亡指令”通过死亡配体传达给死亡受体，继而传到细胞内引起Caspase-8/10的活化。一些常见的死亡配体及受体包括Fas配体/受体(FasL/FasR)、肿瘤坏死因子配体/受体(TNF-α/TNFR1)、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体/受体(TRAIL/DR4)等[11]。以Fas受体为例，当细胞被病毒刺激后，细胞毒性T细胞分泌FasL，FasR与之结合发生构象改变，募集包浆内Fas相关接头蛋白(FADD)。FADD分子的C端通过自身DD结构域与FasL/FasR复合体相连，N端通过死亡效应结构域(DED)吸引同样含有DED的pro-Caspase-8，形成由FasL、FasR、FADD、pro-Caspase-8组成的死亡诱导信号复合体[12]。Pro-Caspase-8在复合物中释放Caspase-8，Caspase-8再作用于下游的酶原，活化Caspase-3、Caspase-7，执行凋亡事件。虽然Caspase-8和Caspase-10在结构上有很高的同源性，功能也类似，但是具有不同的底物特异性，不可相互替代[13]。

1.4 Caspase-9参与内源性细胞凋亡途径

线粒体响应细胞内产生的应激信号，由线粒体蛋白决定细胞是否进入凋亡程序。线粒体蛋白主要是B细胞淋巴瘤-2(B-cell leukemia-2,Bcl-2)家族蛋白，Bcl-2家族分为抑制凋亡的Bcl-2亚族及促进凋亡的Bcl-2相关X蛋白(Bcl2 associated X protein,Bax)、Bcl-2相关K蛋白(Bcl2 associated K protein,Bak)亚族等[14]。Bcl-2家族通过彼此间的聚合和解聚，改变线粒体外膜通透性，线粒体外膜通透性增加后，线粒体膜间隙蛋白成分如细胞色素C(Cytc)、第2个线粒体衍生半胱氨酸蛋白酶激活因子(SMAC)、丝氨酸蛋白酶(Omi)被释放到细胞质中，成为点燃细胞凋亡的”导火索”。Cytc在胞质中与凋亡酶激活因子-1(Apaf-l)结合形成凋亡复合体[15]，暴露出CARD结构域吸引pro-Caspase-9，Caspase-9经SMAC、Omi活化后脱离激活下游的Caspase-3/7，执行细胞凋亡。细胞凋亡的内外途径并不是相互孤立的，通过死亡受体途径活化的Caspase-8可以间接激活下游的线粒体途径。Caspase-8能剪切Bcl-2家族中的一种促凋亡蛋白(Bid)，切割产生的Bid片段会转移到线粒体外膜,与外膜结合并激活膜上的Bax和Bak，引起线粒体外膜通透性增加和Cytc等促凋亡物质释放[16]。

1.5 Caspase-12参与内质网应激介导的凋亡通路

内质网是蛋白质折叠、修饰和转运的重要场所，但只有折叠正确的蛋白质才能从内质网转运至高尔基体，折叠错误或未折叠的蛋白质则通过内质网的降解通道引发应激反应。适度的内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)，有助于异常蛋白质进行正确折叠，转运出去发挥正常的生物学效应，超负荷的ERS则通过蛋白激酶样内质网激酶、肌醇依赖性激酶1α(inositol requiring enzyme1α，IRE1α)、活化的转录因子6三条信号通路引发细胞凋亡[17]。Caspase-12位于内质网的表面，是IRE-1α通路的效应蛋白，基因突变、氧化应激、缺血缺氧等生理或病理刺激可能导致蛋白质折叠出现异常，继而触发ERS，形成IRE-1α-肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)复合体。TRAF2诱导pro-Caspase-12并与之结合，Caspase-12从复合物中解离出来，经过级联反应激活Caspase-3及Caspase-7。Caspase-3与Caspase-7是细胞凋亡的终末剪切酶，可被内源性、外源性、内质网应激3种途径激活，降解各种细胞骨架蛋白、核蛋白，发挥促凋亡作用[18]。

2 Caspase家族与心血管疾病

2.1 炎症Caspases与心血管疾病

Caspases-1介导的细胞焦亡与心血管疾病的炎性过程密切相关。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种慢性炎症性疾病，现已发现胆固醇晶体、氧化的低密度脂蛋白等刺激物可激活巨噬细胞或内皮细胞中的NLRP3-Caspases-1通路，促进AS炎症反应的发生[19，20]。在颈动脉粥样硬化的斑块中也发现，NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18较健康的肠系膜动脉明显增加，且不稳定斑块中上述指标的表达水平比稳定性斑块更高[21]。1项临床研究证实，冠心病患者外周血中的NLRP3水平高于非冠心病患者，阿托伐他汀可能通过经典细胞焦亡途径降低IL-1β、IL-18水平[22]。高血压也与Caspases-1存在相关性，可能导致某些DAMPs水平升高，而这些DAMPs又会激活 NLRP3炎症小体[23]。1项实验发现，NLRP3抑制剂MCC950能有效降低血压，抑制肾脏炎症、纤维化和功能障碍[24]。心力衰竭是多种心血管疾病的终末阶段，研究表明NLRP3可产生心脏重塑作用，加重心衰过程[25]。另外，心房颤动常伴有炎症反应增强。有研究发现，慢房颤患者心肌细胞中Caspase-1、NLRP3、ASC水平增加，快房颤患者的Caspase-1-p20水平增加[26]。相较于Caspases-1，Caspases-4/5/11在心血管领域的研究相对匮乏，目前并未有直接证据表明其参与心血管疾病的发生发展。

2.2 凋亡Caspases与心血管疾病

巨噬细胞、心肌细胞、血管平滑肌细胞凋亡在AS、心肌缺血/再灌注损伤、心肌病、心衰和心律失常的作用于上世纪90年代已形成初步认识[27]，凋亡Caspases与内质网应激的发现使相关理论变得更加成熟。研究发现，内质网应激参与了AS晚期巨噬细胞凋亡形成斑块的病理过程[28]。高血压诱导的氧化应激会激活内质网应激，继而诱发心肌细胞凋亡，形成高血压早期的心肌肥厚和晚期的舒张性心力衰竭[29]。Caspase-12是调控内质网应激的关键蛋白，在心肌缺血/再灌注损伤、心力衰竭、心脏肥大的过程中也会出现Caspase-12的高表达[30]。Caspase-3是细胞凋亡的终末蛋白，既往研究表明Caspase-3升高见于AS、心肌缺血、心肌病、心力衰竭[31]。此外，Caspase-3与心肌梗死关系密切。1项研究纳入27例接受心脏介入手术的急性心梗患者，发现心梗急性期、梗死后及健康对照组的血清Caspase-3p17肽段水平(中位数及四分位数)依次降低，峰值期的p17肽段水平与cTnI、CK-MB呈正相关[32]。动物实验表明，抑制Caspase-3表达能降低梗死面积和心肌细胞的凋亡指数，改善心脏功能[33]。

3 中药复方干预Caspases的研究进展

中药复方能调节Caspases及上下游分子的表达，从而干预细胞焦亡与细胞凋亡途径。这为中药治疗心力衰竭、冠心病、高血压的机制研究提供了新的科学依据(见表1)。

表1 中药复方干预Caspase的研究进展

3.1 心力衰竭

中药复方可通过细胞凋亡的3种途径干预心力衰竭。1项研究观察参附益心方对受损心肌细胞的影响，发现该方除使线粒体数量增加、活性增高外，还可从基因和蛋白水平降低Caspase-3、Caspase-9、Bax的表达，促进Bcl-2的表达，但对Caspase-8的表达则无明显的下调作用[34]。1项研究用补益强心片治疗缺血诱导的心衰大鼠，同时检测磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)的表达，结果显示它可以激活PI3K-Akt信号通路，同时抑制Bax、Caspase-3的表达[35]。1项研究探讨芪参益气汤治疗心衰大鼠的作用机制，发现芪参益气汤可升高mi-RNA133a及其下游蛋白Bcl-2、Caspase-9的表达水平[36]。在1项关于益气泻肺汤的实验中，益气泻肺汤低剂量组观察到抑制Bax表达，中剂量组可上调Bcl-2蛋白表达，高剂量组降低了Caspase-3的表达[37]。进一步的研究表明，益气泻肺汤干预心衰是通过抑制TLR4受体/核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)蛋白介导的炎症通路及Caspase-8介导的细胞外凋亡通路、Bax蛋白介导的细胞内凋亡通路发挥作用的[38]。另外研究表明，降糖舒心方[42]、强心胶囊[43]对Caspase-12的表达有抑制作用，可能通过内质网应激减轻细胞凋亡，其他干预Caspase-3/9的中药复方还有心康冲剂[39]、参桂宝心方[40]、真武汤[41]、参桂保心浓煎剂[52]。

3.2 动脉粥样硬化与冠心病

内皮损伤和脂质沉积引发的炎症反应是AS的病理基础，巨噬细胞焦亡扩大炎症反应，平滑肌细胞凋亡破坏斑块的稳定性，中药复方可有效干预上述环节。清心解瘀方是陈可冀院士治疗心肌梗死的经验方，研究证实清心解瘀方可调控巨噬细胞焦亡和炎症级联反应，涉及20余条信号通路。清心解瘀方通过下调Caspase-1、NLRP3、DSDMD-N的表达，减少主动脉斑块中巨噬细胞浸润和脂质沉积，改善机体炎症状态和脂质代谢[44]。1项实验探讨温肾化痰方对动脉硬化小鼠的治疗作用，结果表明经温肾化痰方干预后，各中药组的Caspase-3、Caspase-9、Bax表达均降低，而Bcl-2表达增加。且这种变化呈浓度依赖性，高剂量温肾化痰方干预后的基因表达与空白对照组无明显差异，说明温肾化痰方通过抑制血管平滑肌细胞凋亡，改善AS斑块的形成及发展[45]。与之类似，稳斑汤能降低小鼠主动脉组织中Caspase-3、Bax的基因及蛋白表达，改善不稳定斑块的形成和破裂情况[46]。1项研究探讨瓜蒌薤白半夏汤合血府逐瘀汤治疗心肌缺血损伤的作用机制。该研究表明，痰瘀同治能诱导Bcl-2的表达，抑制Bax的表达，并能抑制Caspase-3、Caspase-9的蛋白酶活性[47]。可见，中药复方可通过经典炎症小体途径与线粒体介导的凋亡途径改善心肌供血及稳定/不稳定斑块的形成和发展。

3.3 高血压及相关代谢紊乱

中药复方可通过细胞焦亡与细胞凋亡途径干预高血压病的左室肥厚及代谢紊乱。三草降压汤是刘渡舟教授治疗高血压的经验方。1项实验通过NF-κB及NLRP3-IL-1β信号通路研究三草降压汤的作用机制，结果显示三草降压汤高、中剂量组可降低血清IL-1β、心脏组织中NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、IL-1β基因及蛋白表达。研究者认为，三草降压汤的降压及保护靶器官作用正是通过其抗炎作用发挥的，且这种作用优于卡托普利[48]。1项研究通过“血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)-ERS”通路观察活血潜阳祛痰方对高血压左室重构大鼠的治疗作用，治疗后大鼠心肌组织中葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、Caspase-12表达下调。作者认为中药改善大鼠的血压、糖脂指标及左室重构的作用，可能与其调控心肌局部AngⅡ-GRP78-Caspase-12凋亡通路有关[49]。针箭颗粒由清肝滋肾中药组成，1项研究通过沉默调节蛋白1(sirtuin 1,Sirt1)探讨针箭颗粒Ⅱ号治疗高血压代谢紊乱的作用机制。Sirt1蛋白是Caspase-1的底物，Caspase1能选择性剪切Sirt1，使其表达降低。研究发现，针箭颗粒干预后，大鼠肝脏组织Caspase-1蛋白表达下调，Sirt1蛋白表达上调[50]。1项研究观察天麻钩藤饮对Bax、Caspase-3蛋白表达的影响，发现天麻钩藤饮能明显降低收缩压、AngⅡ及醛固酮水平，并使心肌组织的Bax、Caspase-3蛋白表达降低[51]。

4 小结与展望

Caspase家族包括炎症Caspases与凋亡Caspases，参与固有免疫与细胞凋亡过程中的多条信号通路。Caspase-1介导的经典细胞焦亡途径与Caspase-3/7/8/9/10/12介导的凋亡途径在AS、冠心病、高血压、心力衰竭、心律失常等疾病中发挥重要作用。Caspases-1在 AS中的作用机制已得到初步阐明，但同样介导细胞焦亡的Caspases-4/5/11在AS中作用尚不清楚，有待进一步探索。炎症Caspases为冠心病的靶向“抗炎疗法”提供了新的思路，有望成为新的干预策略和治疗靶点。尽管目前已有较多关于Caspases家族成员与心血管疾病关系的研究，但这些研究多是相关性研究，还需要深入探索两者之间的作用机理。近5年来，中药针对Caspases干预心血管疾病的研究逐渐增多，主要集中在心力衰竭、动脉粥样硬化性疾病、高血压相关代谢紊乱上。中药复方能够调控Caspases及其上下游分子的表达，有利于从细胞焦亡与细胞凋亡角度阐释其对心血管疾病的治疗作用。但是，目前的研究多针对单一Caspases进行检测，反映的是中药对“单靶点、单通路”的治疗效果，未来的研究可同时开展对多种Caspases成员的检测，以明确中药作用机理，进一步阐明中医方证内涵。