中药调控胞葬作用物质基础及用药规律的研究❋

王建茹，李 彬，王新陆，彭广操，赵齐飞，于 瑞，王永霞，朱明军

(河南中医药大学第一附属医院，郑州 450000)

胞葬作用(Efferocytosis)是指胞葬细胞将死亡细胞及时清除的过程[1，2]。人体内每天都有数十亿细胞发生死亡，死亡细胞与胞葬细胞通过不同信号传导，促进其被及时有效的清除，介导各种不同的病理生理结果[3]。胞葬作用介导多种系统疾病的病理过程，在维持组织稳态、组织修复等方面发挥着重要作用，已成为近几年治疗疾病的潜在性干预靶点和新的研究方向[3，4]。

中药及其复方具有多成分、多靶点、多途径和多效应的特点，在治疗疾病方面表现出明显的优势[5]。研究报道，具有益气活血祛痰功效的中药复方冠心康可改善动脉粥样硬化病理过程中受损的巨噬细胞胞葬作用，其机制可能与其上调胞葬作用相关信号分子的表达有关。这提示中药通过干预胞葬作用治疗疾病具有广阔的应用前景[6]，但目前这方面的相关研究较少。网络药理学具有整体性和系统性等特点，分子对接技术是预测受体分子与配体化合物结合模式和亲合力的方法，两者联合已被广泛用于阐释中药治疗疾病的物质基础和潜在作用机制的研究中[7-9]。

本研究以胞葬作用这一热门表型为切入点，利用网络药理学和分子对接方法，系统预测胞葬作用相关靶点、活性成分和中药三者之间的复杂对应关系，同时挖掘中药性味归经的分布情况，初步探讨中药调控胞葬作用的药效物质基础及一般用药规律，以期为后续治疗胞葬作用功能障碍相关疾病、药物的研发以及中医药现代化等方面的研究提供一定的科学依据。

1 对象与方法

首先从GeneCards数据库中获取胞葬作用相关靶点。其次在中药系统药理学数据库与分析平台(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)数据库中，以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、类药性(drug-likeness,DL)≥18%为条件，筛选出作用于胞葬作用相关靶点的活性成分，并在TCMSP数据库中匹配出包含这些活性成分的中药，然后再利用Autodock Vina软件进行分子对接，以验证中药活性成分与胞葬作用相关靶点之间映射结果的科学性和可信性；同时，利用Cytoscape软件构建活性成分-靶点网络、表型-靶点-成分-中药网络进行可视化，并采用软件中的Network Analyzer工具进行网络拓扑分析，筛选关键网络节点。最后在中医药整合药理学研究平台V2.0、化学专业数据库、中国医药信息查询平台中收集已匹配出的中药性味归经信息，统计分析其出现的频次和频率，并对中药用药规律进行分析，具体步骤见图1。

图1 研究思路图

1.1 收集胞葬作用相关作用靶点

为获取与胞葬作用相关的作用靶点，在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)中以“efferocytosis”为检索词进行检索。由于不同数据库基因代号不统一，需通过Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)对所有作用靶点名称进行标准化。

1.2 筛选中药的活性成分

TCMSP是一种独特的从系统水平研究中药作用机理的平台，包含499味草药以及每味草药的化合物成分(共计29000余个)，针对每个化合物提供了较全面的人体吸收、分布、代谢等药代动力学数据，同时也提供了潜在活性分子靶标及其疾病信息，形成了针对每位草药的药物-靶标-疾病网络。将1.1获得的胞葬作用相关靶点输入到TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)中，以OB≥30%、DL≥18%为条件，筛选中药的活性成分。

1.3 构建中药活性成分-靶点网络图

将1.1获得的胞葬作用相关靶点和1.2获得的中药活性成分导入Cytoscape 3.7.2软件，构建活性成分-靶点网络图，将两者的映射关系进行可视化，然后利用Network Analyzer工具分析网络拓扑参数，识别关键网络节点。

1.4 活性成分-胞葬作用相关靶点分子对接

为验证预测的胞葬作用潜在作用靶点与中药活性成分之间相互作用关系的可信度，将胞葬作用潜在作用靶点与其所对应的活性成分进行分子对接。首先，从蛋白质数据库(protein data bank,PDB，http://www.rcsb.org/pdb/)中检索人源胞葬作用相关靶点的PDB ID号，用PyMOL软件去除水分子和配体等，Auto dock Tools软件加氢然后转换成pdbqt格式。其次，从PubChem数据库 (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载中药活性成分的分子结构，保存为SDF格式，再用ChemBio3D进行优化，保存为mol2格式。最后，利用Autodock Vina软件进行分子对接，获取结合能值，对接结果采用Discovery Studio Visualizer 4.5和PyMOL软件进行可视化。结合能数值为负则提示活性成分与作用靶点可自由结合，数值越小说明对接体系越稳定，对接结果越可靠。本研究设定自由结合能小于-5 kcal/mol代表结合具有显著性，说明活性成分与靶点之间作用关系可信度高。

1.5 构建“表型-靶点-成分-中药网络图”

在excel表中分别构建“中药-活性成分”“活性成分-靶点”“靶点-表型”文件，并将这些文件输入到Cytoscape3.7.2软件中，利用Network Analyzer工具进行网络拓扑参数分析，筛选出关键节点，并构建“表型-靶点-成分-中药网络图”进行可视化。最后，依据网络中各节点拓扑学参数信息，初步评价中药及其活性成分调控胞葬作用的功效强度。

1.6 中药获取及其数据整理分析

为获取具有调控胞葬作用的中药，将1.2中获取的具有调控胞葬作用的中药活性成分输入到TCMSP数据库中收集匹配的中药。为分析具有调控胞葬作用中药的用药规律，将匹配出的中药再输入到中医药整合药理学研究平台V2.0(http:∥www.tcmip.cn/)、化学专业数据库(http:∥www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp)、中国医药信息查询平台(https:∥www.dayi.org.cn/)中收集这些中药的性味归经信息，并统计分析各个中药性味归经出现的频次和频率。若中药的性味归经不止1个，则要全部如实记录。出现频率=出现频次/总频次×100%。

2 结果

2.1 胞葬作用相关靶点的筛选

从Gene Cards数据库中共检索到与胞葬作用相关的靶点73个，其中41个靶点在TCMSP数据库中没有收录，8个靶点虽有收录但无匹配的化合物，24个靶点检索到匹配的化合物。以OB≥30%、DL≥18%为条件，对24个靶点匹配的化合物进行筛选，结果10个靶点的化合物不符合标准，其余14个靶点匹配的化合物符合，这14个靶点即为胞葬作用的潜在靶点，在胞葬作用的过程中充当不同角色，并发挥着不同的功能(见表1)。

表1 胞葬作用的潜在靶点信息

2.2 中药活性成分的获取

在TCMSP数据库中，以OB≥30%、DL≥18%，并能匹配胞葬作用的潜在靶点为条件对中药的活性成分进行筛选，结果共获得24个活性成分(见表2)。将24个活性成分在TCMSP数据库中分别匹配中药，汇总剔除重复中药后共获得368种药物。368味中药所包含活性成分的数量在1～12个之间，其中含有1个活性成分的中药最多达102味，其次是含有6个活性成分的中药共72味；另外，含有12个活性成分的中药有2味分别为半枝莲和木蝴蝶，有1味中药(白果)含有11个活性成分(见图2)。

图2 预测中药所包含活性成分分布情况比较

表2 中药活性成分信息比较

2.3 活性成分-靶点网络图的构建

活性成分-靶点网络图由38个节点、78条边组成，度值范围为1～12，平均度值为2.053；网络中节点代表活性成分或靶点，边表示节点间的作用或对应关系，度值表示与该节点直接相互作用节点的数目，度值越大说明该节点的枢纽性越强，在整个网络中的调控作用越大，生物学功能的重要性越强。

图3中的蓝色圆形节点代表中药活性成分，红色六边形节点代表胞葬作用潜在靶点；其中度值排名前8位的活性成分分别关联2个以上的靶点；度值排名前7位的靶点分别映射2个以上的中药活性成分。结果提示，这些活性成分和靶点较重要，可对其进一步开展深入研究。

图3 活性成分-靶点网络图

2.4 分子对接结果

结果表明，提取出的39对“活性成分-作用靶点”关系对中，胞葬作用潜在靶点与中药相关活性成分均存在不同程度的结合，结合自由能均小于-5 kcal/mol，说明预测结果具有一定的科学性和可靠性(见表3)。结合自由能≤ -9.5 kcal/mol的3对关系对的分子对接结果示意图，显示活性成分与胞葬作用潜在靶点之间具有良好的亲和力，两者大多以氢键的形式相互作用(图4)。

表3 活性成分与胞葬作用相关靶点分子对接信息比较

注：A.Baicalein-ALOX12；B.Triptolide-CD274；C.Quercetin-NFE2L2;A-1、A-2、B-1、B-2、C-1、C-2为对接空间位置的3D立体图；A-3、B-3、C-3为对接作用的2D平面图图4 活性成分与靶蛋白分子对接结果示意图(结合自由能 ≤ -9.5 kcal/mol)

2.5 “表型-靶点-成分-中药网络图”的构建

根据预测的中药与其所含有的活性成分以及胞葬作用潜在靶点的对应关系，初步构建“表型-靶点-成分-中药网络图”，该网络中共含407个节点，1594条边，度值范围为1～7，平均度值为3.916。度值排名前3的中药共12味占比3.26%，这些药物除黄芩、鸡血藤外，其余10味中药所关联的胞葬作用潜在靶点均在9个以上(见图5、6)，结果表明半枝莲、木蝴蝶、苦参、白果、葛花、红花、黄柏、麻黄、牛膝、山豆根这10味中药在干预胞葬作用方面具有较大的潜在调控作用。本研究选取度值≥4的中药及其所关联的活性成分、胞葬作用潜在靶点重新构建网络图，以便直观地展示胞葬作用潜在靶点、活性成分、中药之间的对应关系(如图7)，红色菱形节点代表胞葬作用这一表型，紫色V节点代表与胞葬作用相关的潜在靶点，绿色三角形节点代表预测的能调控胞葬作用的活性成分，黄色圆形节点代表预测的具有调控胞葬作用的中药。

图5 预测中药度值的分布情况

图6 预测中药对应胞葬作用相关靶点的分布情况

图7 表型-靶点-成分-中药网络图

2.6 中药性味归经的分布情况

368味中药性微温者有3味，微寒者12味，均按性温、性寒记录；药味微酸者2味，微甘者1味，微辛者3味，微苦者10味，均按味甘、味辛、味苦记录；有9味药物未收集到归经信息。对中药的性味归经频次进行统计，发现药味总频次为587次，药性总频次为368次，归经总频次为835次。具有调控胞葬作用的中药在药味方面以味苦的出现频次和频率最高，其次为味辛和味甘；在药性方面，以性寒的出现频次和频率最高，其次为性温和性平；在归经方面，以肝经的出现频次和频率最高，其次为肺经、胃经(见表4图8)。

图8 中药的归经分布

表4 中药的性味分布

3 讨论

胞葬作用由专职的和非专职的吞噬细胞(即胞葬细胞)完成，其中主要的细胞类型为巨噬细胞，胞葬细胞与死亡细胞通过它们表面的食我信号和寻我信号，以“配体-受体”的直接结合形式和“配体-调理素-受体”的间接结合形式，完成对死亡细胞的识别、捕获、降解过程，从而抑制促炎因子和毒性分子的释放，促进抗炎因子的释放；同时，非食我信号分子可负性调控以上2种结合形式[10]。此外，胞葬过程还受一些非胞葬作用相关信号分子的调控[11]。本研究预测的14个胞葬作用潜在靶点中，大多为非胞葬作用相关信号分子和食我信号分子，这些靶点中白介素-6(interleukin 6,IL-6)、白介素-1β(interleukin 1 beta，IL1B)、尿激酶型纤溶酶原激活物受体(plasminogen activator urokinase receptor，PLAUR)、转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)、白细胞分化抗原14(cluster of differentiation 14，CD14)、核转录NR-E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，NFE2L2)、白细胞分化抗原274(cluster of differentiation 274，CD274)的功能作用较重要，值得进一步深入研究。由于检索数据库的不完善，一些已经被证实的介导胞葬过程的信号分子未被筛选出来，如Mer受体酪氨酸激酶(mer tyrosine kinase，MerTK)、T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域含4(t cell immunoglobulin and mucin domain containing 4,TIMD4)、乳脂球-表皮生长因子8蛋白(milk fat globule-EGF factor 8 protein,MFGE8)、白细胞分化抗原47(cluster of differentiation 47，CD47)等。

活性成分-靶点网络显示，具有调控胞葬作用潜在靶点的24个中药活性成分大多属于黄酮类化合物、生物碱和萜类化合物，其中槲皮素(quercetin)、雷公藤甲素(triptolide)、表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-gallate]、汉黄芩素(wogonin)、非瑟酮(fisetin)、芍药苷(paeoniflorin)、胡椒碱(piperine)、青藤碱(sinomenine)在调控胞葬作用方面表现出明显的潜力，成为调节剂的可能性较大。研究显示，这8个活性成分均具有调控炎症反应的作用[12-18]，除了青藤碱外其余7个活性成分还可调控巨噬细胞的吞噬作用[18-23]，说明这些活性成分的功能作用与胞葬的作用机制相吻合，验证了本研究的预测结果。同时值得注意的是，网络中另一个活性成分花生四烯酸(arachidonic acid)，其度值虽小，但已被证明是一个具有胞葬作用的抑制剂，它可通过活化Rho诱导细胞形态变化，从而抑制巨噬细胞的胞葬作用[24]。此外，网络中多种活性成分如槲皮素、胡椒碱等在植物类食品中也被发现，提示本研究所预测的结果可为胞葬作用功能障碍相关疾病的食疗提供一定的研究思路与依据。

分子对接技术可快速有效地预测指定蛋白与配体之间的结合模式和结合自由能，进而指导研究者对其功能及作用机制进行深入探索研究[25，26]。本研究分子对接的结果显示，39对“活性成分-作用靶点”关系对的结合自由能均小于-5.0 kcal/mol，这提示中药活性成分与胞葬作用潜在靶点之间具有良好的结合力；其中Baicalein-ALOX12、Triptolide-CD274、Quercetin-NFE2L2的结合自由能均小于-9.5 kcal/mol，这3对关系对相互之间大多以氢键的形式结合，表现出最强的结合能力，具有深入开发研究的价值。研究显示，黄芩素(Baicalein)为ALOX12的天然选择性抑制剂[27]，雷公藤甲素(triptolide)能负性调控CD274的表达[28]，槲皮素(quercetin)可正性调控NFE2L2的表达[29]。这些研究进一步验证了网络药理学预测的“活性成分-作用靶点”关系对的可靠性。

在中药筛选方面，网络药理学预测共有368味中药与胞葬作用相关联，其中半枝莲、木蝴蝶、苦参、白果、葛花、红花、黄柏、麻黄、牛膝、山豆根的度值均在5以上，其所关联的胞葬作用潜在靶点均在9个以上，提示这10味中药在调控胞葬作用方面表现出较大的潜力，尤以半枝莲最为重要。频次频率分析结果显示，与胞葬作用相关的中药大都归肝经、肺经，药味多为苦、辛，药性以寒、温为主，这提示胞葬作用的机制与中医肝经、肺经、味苦、味辛、性寒、性温的关系密切相关。中医阴阳五行学说认为，肺属金，金曰从革，有沉降、肃杀、收敛等性质或作用，为阳中之阴；肝属木，木曰曲直，有生长、升发、条达、舒畅等性质或作用，为阴中之阳。这一理论认识与频次频率分析的与胞葬作用相关联的368味中药性味归经规律结果不谋而合。此外，中医学认为肝藏血主疏泄，肺朝百脉主治节，两者的相互作用关系集中体现在调控全身气机升降和气血运行方面，因此胞葬作用功能障碍的中医病机可能为气机不畅、气血失和，遣方用药时需注重调畅气机、调和气血。

综上所述，本研究以胞葬作用这一方兴未艾的疾病表型为切入点，利用网络药理学、分子对接、数据挖掘方法，较为系统地探讨了中药干预胞葬作用潜在的药效物质基础及其用药规律，发现与调控胞葬作用相关的中药大多归肝经、肺经，性味多为寒、温、苦、辛，中药活性成分多属于黄酮类化合物、生物碱和萜类化合物。本研究结果在一定程度上可为中医临床遣方用药治疗胞葬作用功能障碍相关疾病以及进一步开展探索性实验研究提供了借鉴，助力中医药现代化研究。由于分子对接等信息技术的不全面以及网络药理学所采用的数据库未能实时更新，可能会导致研究预测结果的客观性、精准性与实际情况出现偏颇；此外，本文尚未兼顾中药炮制、煎煮等处理对中药所含化合物之间相互作用的影响。因此，本研究在一定程度上具有一定的局限性，其结果仍需后续基础实验和临床试验研究的进一步观察与佐证。