IL-21单克隆抗体对MRL/lpr狼疮小鼠的治疗作用*

陈旭娥， 马 婷， 盛 良， 王文雯， 李 季

(贵州省人民医院皮肤科， 贵阳 550002)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种以大量自身抗体产生并累及多种脏器为特点的自身免疫性疾病[1]。SLE治疗以糖皮质激素联合免疫抑制剂为主，尽管取得较好临床疗效，但也带来严重不良反应，因此亟需探索安全有效的治疗策略。调节性T细胞(Treg)是一组具有免疫抑制功能的CD4+T淋巴细胞，对维持机体免疫应答稳态和免疫耐受方面具有重要作用；新近发现的辅助性T细胞17(Th17)是一组重要促炎性细胞，介导机体炎性反应。研究已证实，Th17与Treg间失衡与SLE等自身免疫性疾病的发生、发展密切相关；纠正Th17/Treg失衡状态，可减轻SLE炎症损害[2]。

IL-21是一种新型细胞因子，由活化T细胞、NK细胞分泌，刺激B细胞生发中心形成、分化成浆细胞并分泌自身抗体。研究证实，阻断IL-21生物学功能，对风湿性关节炎等自身免疫性疾病有明显疗效[3]。但其对SLE治疗效果及作用机制尚不清楚。MRL/lpr小鼠是1979年由Murphy和Roths首次建立的狼疮模型鼠，由LG/J、ARK/J、C3H/Di和C57BL/6J品系小鼠交配产生，表现为Fas基因隐性突变，T细胞过度增生、全身淋巴结肿大，自身免疫应答亢进；由于MRL/lpr狼疮小鼠的血清学与人类SLE极为相似，因此常作为研究红斑狼疮的理想动物模型。本研究应用IL-21单克隆抗体干预MRL/lpr狼疮小鼠，观察小鼠免疫学指标、Th17/Treg相关细胞因子、肾功能指标等变化，以探讨IL-12单克隆抗体治疗SLE的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取12周龄、雌性MRL/lpr小鼠20只、同性别同年龄C57BL/6小鼠10只，体重均为17～24 g，购于广东实验动物研究所。

1.2 实验动物分组及干预措施

用随机数字表达法将20只MRL/lpr狼疮鼠随机分为模型组、治疗组，每组10只；同时选取10只C57BL/6小鼠作为正常组。治疗组每周一上午10点腹腔注射IL-21单克隆抗体(每只100 μg)，每周1次，连续干预8周；模型组及正常组小鼠相同时间给予等量生理盐水腹腔注射(每只100 μg)。三组小鼠均于治疗结束后一周处死。

1.3 主要试剂

IL-21单克隆抗体购于美国eBioscience公司；兔抗IL-21多克隆抗体购于R&D公司；IL-17A、TGF-β1 ELISA试剂盒购于eBioscience公司；小鼠抗双链DNA(ds-DNA)ELISA试剂盒、小鼠抗核抗体(ANA)ELISA检测试剂盒、小鼠血清肌酐ELISA试剂盒、小鼠血清尿素氮ELISA检测试剂、考马斯亮蓝法检测试剂盒均购于贵州吉创生物技术有限公司。

1.4 一般情况观察

观察各组小鼠的毛色光泽、脱毛情况、活动状态及颈部、腋下、腹股沟淋巴结肿大的情况。

1.5 蛋白免疫印迹(Western blot)

每50 mg肾组织加入500 μl蛋白裂解液，静置30 min后，离心并收集上清液，BCA法检测蛋白浓度。常规SDS-PAGE电泳、转膜、封闭后添加一抗：GAPDH(1∶1 000)、IL-21(1∶500)，置于4℃孵育过夜；加入二抗，室温下放置1 h，洗膜、显影，分析IL-21与GAPDH的总吸光度比值。

1.6 小鼠24 h尿蛋白水平检测

参照说明书、运用考马斯亮蓝检测试剂，采用生物化学法检测三组小鼠24 h尿蛋白水平。

1.7 小鼠血清免疫学指标、肾功能及炎症细胞因子水平检测

处死小鼠后摘眼球取血，静置30 min，2 500 r/min离心15 min，取上层血清，采用ELISA法检测三组小鼠血清中抗ds-DNA抗体、ANA抗体、血尿素氮、肌酐及炎症细胞因子IL-17A、TGF-β1水平，操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 小鼠一般情况结果比较

正常组小鼠皮毛和活动正常，颈部、腋下、腹股沟未见明显肿大的淋巴结；模型组小鼠皮毛晦暗、缺乏光泽，头部皮肤毛发缺损，肿大淋巴结数量明显增多；与模型组比较，治疗组小鼠毛色、皮损明显减轻，均未见毛发缺损，肿大淋巴结数量明显减少。

2.2 小鼠肾脏IL-21蛋白表达检测结果

Western blot检测发现，正常组小鼠肾脏组织IL-21低表达，模型组小鼠肾脏组织IL-21水平较正常组显著升高(P<0.01)；使用IL-21单克隆抗体治疗8周后，治疗组小鼠肾脏IL-21蛋白水平较模型组明显下降，差异有统计学意义(P<0.01，表1，图1)。

Tab. 1 Levels of IL-21 protein in the kidney tissues and urine protein in three groups of n=10)

Fig. 1 The protein level of IL-21 in the kidney tissues of three groups mice detected by Western blot

2.3 小鼠24小时尿蛋白检测结果

正常组小鼠24 h尿蛋白检测结果阴性，而模型组小鼠24 h尿蛋白明显升高(P<0.01)。IL-21单克隆抗体干预8周后，治疗组小鼠24 h尿蛋白水平较模型组显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。模型组、治疗组及正常组小鼠24 h尿蛋白生物化学法检测结果见表1。

2.4 小鼠血清自身抗体(抗ds-DNA抗体、ANA)检测结果

与正常组比较，模型组小鼠血清抗ds-DNA抗体、ANA水平显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)。经IL-21抗体治疗8周后，与模型组比较，治疗组血清抗ds-DNA、ANA水平显著下降，差异有统计学意义(P<0.01，表2)。

Tab. 2 Serum level of anti-ds-DNA antibody and ANA in three groups of mice by ELISA (pg/ml, n=10)

2.5 小鼠血清尿素氮、肌酐检测结果

各组小鼠血清尿素氮、肌酐检测结果见表3。与正常组比较，模型组尿素氮、肌酐水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，治疗组尿素氮、肌酐水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

Tab. 3 Serum level of serum urea nitrogen and creatinine in three groups of mice by ELISA n=10)

2.6 小鼠血清Th17/Treg相关炎症细胞因子IL-17A、TGF-β1检测结果

与正常组比较，模型组小鼠血清IL-17A水平明显升高(P<0.01)、而TGF-β1水平显著下降(P<0.01)，差异有统计学意义。IL-21抗体治疗8周后，治疗组血清IL-17A水平较模型组显著降低(P<0.01)，而TGF-β1水平反而增加(P< 0.01)，差异均有统计学意义。三组小鼠血清Th17/Treg相关炎症细胞因子IL-17A和TGF-β1水平检测结果见表4。

Tab. 4 Serum levels of inflammatory cytokines of IL-17A and TGF-β1 in three groups of mice(pg/ml， n=10)

3 讨论

目前认为系统性红斑狼疮的发病机制可能与遗传及免疫失调有关[4]，B细胞功能亢进是发病关键环节。若治疗不当，部分患者将发展至肾功能衰竭，甚至危及生命[5]。因此，抑制自身抗体产生始终是SLE治疗领域研究焦点[6]。

肾脏受损是SLE最常见的并发症，发病率高且难以治愈，其临床评价指标为尿蛋白定量、血清肌酐、尿素氮水平，SLE活动度评价指标常用抗ds-DNA、ANA水平。为了探讨IL-21单克隆抗体在SLE治疗中的价值，本研究对治疗组小鼠腹腔注射IL-21单克隆抗体，治疗8周后血清抗ds-DNA、ANA、尿素氮、肌酐、尿蛋白定量均明显下降，提示治疗后狼疮活动性降低、自身抗体减少、肾功能改善。Bubier等[7]通过IL-21R-Fc段融合蛋白封闭IL-21R，也取得较好疗效。Zhang等[8]使用IL-21R中和抗体，有效改善NZB/NZW小鼠肾脏、淋巴结及脾脏组织病理学状态。总之，IL-21生物学活性阻断在SLE治疗中可抑制自身抗体产生、减缓肾脏受损这一观点已被众多研究证实，但其具体作用机制仍有待进一步明确。

IL-21是2000年发现的I型细胞因子家族成员，与IL-21R结合并启动JAK/STAT信号通路，促进B细胞分化为分泌免疫球蛋白的自身反应性浆细胞(Ig-secreting autoreactive plasma cell)。JAK/STAT信号通路广泛参与免疫调节，多种细胞外信号刺激引起JAKs的激活，激活的JAKs促使酪氨酸残基磷酸化，进而使STATs磷酸化而被活化，激活的STATs移位到细胞核，启动目的基因表达,发挥生物学作用[9]。研究已证实，JAK/STAT信号通路异常激活与SLE的皮肤损害、肾脏炎症及中枢神经系统疾病有关[10]。IL-21与其受体结合促进IL-21/STAT3自分泌循环，导致STAT3持续激活，诱导ROR-γ表达及Th17细胞分化[11]；而STAT3与Treg细胞Foxp3基因转录启动子上特定部位结合抑制Foxp3表达，诱导Treg向Th17转化[12]。Th17和Treg相互制约、功能拮抗[13]，重塑Th17/Treg免疫平衡在SLE治疗中疗效明确[14]。Th17细胞主要分泌IL-17A、IL-21、IL-22等因子，IL-21促进T细胞向Th17分化，起正反馈促进作用。IL-21、BAFF (B-cell activating factor)和IL-17共同促进B细胞生发中心形成、分泌自身抗体。相反，Treg通过释放免疫抑制因子IL-10、TGF-β，抑制免疫反应，维持免疫内环境稳定。研究已证实检测血清IL-17A、TGF-β1水平，可侧面体现Th17/Treg的分化倾向及平衡状态[15]。本研究发现MRL/lpr狼疮小鼠血清中炎症因子IL-17A水平较高、TGF-β1浓度较低，进一步证实了SLE发病机制中Th17/Treg细胞处于失衡状态；IL-21单克隆抗体治疗后，治疗组小鼠外周血IL-17A水平下降、TGF-β1升高；倾向于纠正IL-17A、TGF-β1紊乱状态，同时伴随狼疮临床表现缓解，自身异常免疫应答得到部分改善。综上所述，IL-21单克隆抗体在SLE治疗领域有较好潜力，其作用机制可能是诱导重建Th17/Treg细胞相关炎症因子平衡，从而减轻SLE脏器损害。本研究对IL-21单克隆抗体治疗SLE进行初步探讨，为SLE治疗研究提供新思路，但其确切免疫学机制尚不清楚，值得进一步深入研究。