利用全细胞膜片钳技术记录大鼠脑片NMDA电流的研究*

黄燕云， 高 洁， 张利娜， 杜相欣， 张雨彤， 郭 霞， 郝 娜， 李建国， 张 宇△

(1. 细胞生理学教育部重点实验室， 2. 山西医科大学生理学系， 太原 030001)

膜片钳技术在1976年由德国科学家Nether和Sakmann 发明，他们首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时记录到乙酰胆碱激活的单通道离子电流[1]。这种技术通过记录细胞膜上单个或几个离子通道开放或关闭引起的电流变化来研究细胞生理功能，已被广泛应用于生命科学领域，尤其是神经科学的许多方面。如记录在脑内功能活动时神经元兴奋性的变化，神经信号的产生和传导，神经环路中突触的传递过程等研究中[2-6]。全细胞记录模式下可以获得细胞膜上所有离子通道的综合特性，能够揭示细胞的电生理状态，进而为研究细胞之间信号传递提供有力的参考信息[7]。由于膜片钳实验在操作时存在一定的技术难度，初学者在实验时总是会遇到各种各样的问题，需要一些经验交流。因有关膜片钳技术的原理和应用在文献和书籍中多有展示，本文将不复赘述，这里主要将笔者记录脑片NMDA电流时的一些经验体会在这里与大家分享。

1 材料与方法

1.1 实验动物

取出生2～3周的雄性SD大鼠(购自山西医科大学动物实验中心)，饲养在温度为(23±1)℃，湿度(50±5)%，自由进食、进水，12 h～12 h昼夜循环光照的动物房内，大鼠领养后在实验室的动物饲养室适应3 d后开始进行实验。

1.2 实验试剂及材料

NMDA受体激动剂NMDA(Abcam公司)，NMDA受体拮抗剂AP-V(Abcam公司)、非NMDA受体(AMPA/KA)拮抗剂CNQX(Abcam公司)、GABA受体拮抗剂Bicuculine(碧云天公司)、NaHCO3、KCl、NaH2PO4、CaCl2、MgSO4、HEPES、Glucose、EGTA、K-Gluconate、Na2-phosphocreatine、Na2-ATP、Na3-GTP和Mg-ATP产自美国Sigma公司，带芯微电极玻璃管GBF150-86-10HP产自美国Sutter公司，一次性使用针灸针0.35mm × 68mm (批号121160120)产自北京中研太和医疗器械有限公司。

1.3 诱发脑片神经元NMDA电流的方法

1.3.1 配置诱导NMDA电流的灌流液： NMDA灌流液(内含100 μmol/L NMDA的孵育液)

1.3.2 自制诱导NMDA电流的刺激电极：将两根针灸针(直径0.35 mm，长68 mm)刷上绝缘漆，晾干后用砂纸打磨掉两尖端的绝缘漆，等高并排固定于热缩管中，两尖端平行间隔约1 mm左右，从电极尾部分别引出2根导线连接至隔离器，然后将刺激电极固定于一铅笔粗细的塑料杆上，夹持于微操送达至目标区域附近(图1)。

Fig. 1 A homemade stimulation electrode

1.4 试剂配制

对于出生2～3周的未成年实验动物，离体脑组织可用含蔗糖的ACSF。

切片液蔗糖ACSF配方(mmol/L)： NaHCO326，KCl 2.5，NaH2PO41.25，CaCl20.5，MgSO47，HEPES 5，Glucose 10，Sucrose 210，渗透压为300～305 mmHg，pH 7.3～7.4。

孵育液配方(mmol/L)： KCl 2.5，CaCl22，NaH2PO41.25，NaCl 124，NaHCO326，Glucose 10，渗透压为300～305 mmHg，pH 7.3～7.4。

电极内液配方(mmol/L)： K-Gluconate 120，KCl 5，HEPES-K 10，EGTA 5，CaCl20.5，MgSO42，Na2-phosphocreatine 5，Na2-ATP 5，Na3-GTP 4，Mg-ATP 4，渗透压为290～300 mmHg，pH 7.35～7.45。

1.5 组织切片制备

切片液，孵育液均需提前通入混合气(95% O2+ 5% CO2)至饱和。取切片液200 ml左右，置于孵育盒中预先冰冻至冰水混合状(内含小冰晶)，另取一个孵育盒倒入适量孵育液室温放置并持续通气。用1%戊巴比妥钠腹腔麻醉后断头，快速取脑组织放到提前准备好的冰冻切片液中。培养皿中放滤纸，滴加切片液，脑组织放在滤纸上，吸干水分的同时用刀片修整脑组织，切取实验需要部位，周围用溶好的琼脂包埋，切片厚度为200～300 μm。切片过程中持续通气。脑片切出后立刻转移至ACSF中，室温孵育1 h即可记录。

1.6 脑片膜片钳记录方法

制备好大鼠脑片后，在全细胞模式下进行电生理记录。用水平电极拉制仪(P-97，Sutter Instrument Co，Novato，CA)将硼硅酸盐玻璃电极拉伸(电阻最好小于6 MΩ)。取一脑片置于浴槽中，用盖网将其压住。封接前先在低倍物镜下找到脑片中的所需细胞，然后在高倍浸水物镜下，通过图像采集软件观察镜下胞体形态、轴突走行。选择合适的目标细胞后，在电脑屏幕上标记定位。在低倍物镜下通过微电极操纵器调整玻璃电极的位置，并使其带有正压入水，记录入水电阻；在高倍浸水物镜下，通过图像采样逐步引导电极到达细胞中。在可视条件下，结合记录软件提供的电极阻抗图形，适时释放正压，并轻施负压，借助钳制膜电位水平获得高阻抗(GΩ级)封接，成功破膜后即可形成全细胞记录方式。通过膜片钳放大器(Axopatch 200B，USA)收集数据，膜电流以10 kHz数字化，以2 kHz下滤波，并存储在个人计算机中用于随后的分析。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 记录大鼠脑片神经元的EPSC和AP

制备好脑片后，选择前扣带皮层吻侧部(rostral anterior cingulate cortex, rACC)脑区合适的神经元进行记录。破膜后，在电压钳模式下，将细胞钳制在-60 mV下，记录神经元的自发放电活动，兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic current, EPSC)，而后在电流钳模式下，I=0时记录神经元的动作电位(action potential, AP)。此步可在正式记录前判断神经元的状态(图2)。

Fig. 2 A showed the recorded EPSC on a neuron, B showed the AP

2.2 直接灌流含NMDA孵育液与给予电刺激诱发NMDA电流幅度的比较

本文比较了在灌流液中直接给予激动剂NMDA与自制刺激电极两种方式来诱发NMDA电流。选择rACC脑区的神经元，将其钳制在+40 mV，通过重力给药系统灌流NMDA(100 μmol/L)得到的电流，给予NMDA受体拮抗剂AP-V(50 μmol/L)后，电流受到明显抑制，孵育液洗脱后电流幅度明显恢复(图3A)；刺激电极给予电压3 V，间隔10 s发放一次刺激诱发的电流，给予NMDA受体性拮抗剂AP-V(50 μmol/L)后，电流受到明显抑制，孵育液洗脱后电流恢复(图3B)。实验证明二者诱发的电流都为NMDA电流，且二者诱发的NMDA峰值电流幅度分别为NMDA组(282.0±24.3)pA VS 自制刺激电极组(261.4±40.1)pA，统计学无明显差异(P>0.05，n=4)。

Fig. 3 Comparison of two ways to generate NMDA currentsA: The curves of the induced NMDA current were shown after an agonist NMDA (100 μmol/L) administration; B: The curves of the excited NMDA current were shown after electrical stimulation

2.3 两种刺激电极诱发的NMDA电流幅度的比较

自制刺激电极通过利用一次性使用针灸针改造而成，为了检测自制刺激电极的可靠性，将其与进口刺激电极进行了对比。每组脑片均在rACC脑区选择大小形态类似的神经元各4个，记录给予电刺激前后NMDA电流的变化。刺激电压3 V，间隔10 s发放一次刺激。结果显示两种刺激电极诱发的NMDA电流幅度大小分别为进口刺激电极组(267.2± 36.5)pA VS自制刺激电极组 (239.2±41.0)pA，无统计学意义(P>0.05，图4，n=4)。

Fig. 4 Comparison to the NMDA currents were respectively stimulated at +40 mV potential by an electrode from abroad (A) and a homemade one (B) in incubation fluid withBicuculine (100 μmol/L) and CNQX (20 μmol/L)

3 讨论

与单细胞膜片钳相比较，脑片膜片钳有前者无法比拟的优点。由于脑片中保存了部分的神经纤维联系，它在一定程度上为神经元提供了接近生理状态下的环境，这样记录的实验结果也更接近于真实。另外，在脑片上确定目标神经元，也从视觉上可以识别或明确它在大脑中的具体位置。

目前全细胞膜片钳技术已广泛应用于各种器官或细胞的科学研究[8,9]，例如心肌成纤维细胞以及脑片神经元，但对该技术掌握还有一定的难度。对于脑片膜片钳实验，首要是保证脑片的活性。本实验发现：(1)年龄较大的动物(4周龄以上)需先在30℃左右的混合液中孵育30 min，之后移到室温的灌流液中孵育90 min，细胞的状态较好，而鼠龄较小的，如小于3周的动物切片后直接在室温孵育1 h即可记录。(2)脑片孵育过程中，气流不应过大，以免将脑片吹起，造成脑片翻滚；但气流也不宜过小，过小会导致脑片供氧量不足；脑片之间切忌相互重叠，更不能让气泡直接接触脑片。在脑片放入孵育盒后，也不要随意移动脑片的位置。(3)在孵育过程中，如果发现脑片变白(正常应为淡黄色)、脑片打卷不易舒展，说明脑片活性较低。脑片变白可能为缺氧时间过长，即混合气中O2的比例偏低或气流过小。脑片打卷可能是因为脑片厚度较薄或厚薄不均匀所致。脑片不易舒展可能是孵育液的渗透压不合适。(4)脑片孵育盒中的液体量不必太多，液面可没过脑片3～5 mm高度即可，这样既可以保证脑片的供氧，维持液体的pH，也不浪费液体。

在给药方式上，本研究先后尝试了重力灌流给药和局部微量给药两种方式。结果发现，局部微量给药的优点是快速、节省试剂。该方法虽然可以快速将设定浓度的药物送至靶细胞附近发挥作用，但是由于受到目标细胞周围组织的影响，药物扩散至细胞发挥作用的稳定性不佳，因此局部微量给药更适合急性分离或培养细胞的膜片钳实验。重力灌流给药具有药物可对细胞充分作用、细胞有更稳定反应的优点，但是它有药物发挥作用时间长、比较浪费昂贵试剂的缺点，而且由于药物作用的影响，一张脑片只能记录一个细胞在药物干预前后的电流变化。

研究中在记录NMDA电流时[10,11]，尝试了电刺激诱导NMDA电流的方法。该方法具有细胞反应快速、稳定，节省试剂，避免了药物灌流诱导电流时对脑片其它神经元的影响，这样一张脑片就可记录多个神经元的NMDA电流。实验中要注意需将刺激电极置于靠近目标区域的位置。在实验初期因本实验室无刺激电极，就利用针灸针自制了刺激电极，成功诱导出稳定的NMDA电流。后期获得了国外的刺激电极，其诱导出的NMDA电流与我们自制电极诱导的NMDA电流大小比较无统计学意义。从我们的实验结果来看，自制的刺激电极也可以成功的诱发NMDA电流，自制的刺激电极具有更加方便、廉价、易获得的优点。刺激电极制作时要注意，两根针灸针靠近的部位要刷绝缘漆，防止接入刺激器正负极时发生短路；而电极的尖端，即给脑片施加电刺激的尖端则要避免被绝缘漆包裹，正负极尖端之间的间隔大约1 mm。由于进口刺激电极价格昂贵且不易购买到，本实验室通过多次尝试摸索出一种自制脑片刺激电极的方法。通过自制电极诱发的NMDA电流与受体激动剂诱发的电流以及进口电极诱发的电流相比，结果高度一致且稳定性好，说明自制电极的制作是成功的。这为经费不很充足的实验室记录NMDA电流或开展类似实验提供了可行途径。

随着技术的发展与进步，将膜片钳技术与其它技术，尤其是一些新兴技术相结合来解决科学问题已是未来研究的趋势。例如将膜片钳与原子力显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、双光子显微镜、荧光探针、分子生物学技术等其他检测技术结合应用。这些技术不仅提高了细胞电生理探测的分辨率及灵敏度，还可以同时获取细胞的电生理信息和各种与之相对应的力学或分子生物学信息，极大地弥补了膜片钳技术检测信号单一的缺点[12-14]。因此，膜片钳技术仍然是生命科学研究中具有独特作用的必备手段。