miR-670-5p对肺癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响*

李洪霞， 刘 芳， 夏俊华

(临沂市胸科医院， 山东 临沂 276034)

我国是肺癌高发国家之一，肺癌患者年死亡人数已超过60万，更有专家预测到2025年肺癌年死亡人数将高达100万[1]。由于起病隐匿，肺癌确诊时多为中晚期或发生转移，失去最佳治疗时机，大大缩短了患者的生存期。因此，了解肺癌发生转移的分子机制，寻求早期诊断标志物或治疗靶点对改善肺癌患者治疗现况意义重大。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是短链非编码RNA，其在机体生长、发育和维持机体稳态的各种基因调控中发挥重要作用，与人类疾病密切相关，尤其是癌症[2]。大量研究表明miR-186[3]、miR-149[4]、miR-367[5]等多种miRNA作为癌基因或抑癌基因调控下游基因或蛋白表达参与肺癌肺癌发生和转移。miR-670-5p是miRNAs成员之一，近期研究显示肝癌组织、细胞中miR-670-5p表达上调，miR-670-5p高表达促进肝癌细胞增殖[6]。但目前尚未有miR-670-5p在肺癌中潜在作用的相关研究。因此，本研究通过检测肺癌组织中miR-670-5p的表达水平，观察抑制miR-670-5p对肺癌细胞增殖、迁移侵袭的影响，初步探索其可能的分子机制，以期为miR-670-5p在肺癌临床诊疗中的应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 组织样本

收集2016年1月至2017年10月于我院进行肺癌切除患者的肿瘤组织和癌旁组织28例，病理类型均为非小细胞肺癌。取出的肿瘤组织和癌旁正常组织立即经液氮冷冻并于-80℃冰箱保存。所有患者术前均未接受其他治疗。其中男性22例，女性6例；年龄50～72岁，中位年龄61岁。本研究在开展前经本院伦理委员会批准。

1.2 细胞和试剂

人肺癌细胞株A549购于美国ATCC；RPMI-1640培养液、胎牛血清、青链霉素双抗购于美国Gibco公司；模拟物阴性对照(miR-NC)、miR-670-5p模拟物(miR-670-5p mimics)、抑制物阴性对照(anti-miR-NC)、miR-670-5p抑制物(anti-miR-670-5p)、小干扰RNA阴性对照(si-NC)、WWOX小干扰RNA(si-WWOX)购于上海吉玛制药技术有限公司；野生型荧光素酶报告载体(WT-WWOX)、突变型荧光素酶报告载体(MUT-WWOX)购于Promega公司；Trizol试剂、细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit 8，CCK-8)、二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；Transwell小室和基质胶购于美国BD公司；鼠源P21抗体、鼠源上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)抗体购于美国CST公司；兔源基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)抗体、兔源磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体购于美国Abcam公司；山羊抗鼠抗体、山羊抗兔抗体购于广州锐博生物。

1.3 人肺癌A549细胞的培养

采用DMEM培养基(10%胎牛血清和1%青链霉素双抗)在37℃、5% CO2培养箱培养，取对数期细胞进行后续实验。

1.4 实验分组和处理

将对数期A549按照2×105cells/well的密度接种6孔板，当细胞生长至50%融合时按照LipofectamineTM2000使用说明进行细胞转染。将转染RNA与opti-MEM培养液混合，孵育5 min；同时将LipofectamineTM2000与opti-MEM培养液混合，孵育5 min。将上述混合物混匀，室温孵育20 min，然后加至50%融合A549。根据转染RNA不同分为以下几组。anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、anti-miR-670-5p组(转染anti-miR-670-5p)、miR-NC组(转染miR-NC)、miR-670-5p组(转染miR-670-5p mimics)、anti-miR-670-5p+si-NC组(转染anti-miR-670-5p与si-NC)、anti-miR-670-5p+si-WWOX组(转染anti-miR-670-5p与si-WWOX)。收集转染48 h细胞，实时荧光定量PCR(RT-qPCR)或蛋白质印记(Western blot)检测转染效果，随后进行下一步实验。

1.5 RT-qPCR检测miR-670-5p的表达水平

Trizol试剂分别提取肺癌组织、癌旁组织、按照上述分组进行干预的各组A549细胞的总RNA，逆转为cDNA后，按照Takara荧光定量PCR试剂盒说明书进行PCR反应，以U6为内参，运用2-ΔΔCt分析miR-670-5p的表达水平。每组设置3个复孔，实验重复3次。

1.6 CCK-8法检测细胞活力

将A549细胞接种于6孔板，按照实验分组进行细胞转染，分别在转染24 h、48 h、72 h时，每孔加10 μl的CCK-8试剂，继续培养2 h，酶标仪检测450 nm波长处各孔的吸光度值，绘制细胞活力曲线。每组设置3个复孔，实验重复3次。

1.7 Transwell法检测细胞迁移和侵袭

将Transwell小室置于24孔板中。侵袭实验前，取50 μl按照1∶8稀释的基质胶铺于小室内，4℃凝固后备用。迁移实验无需铺胶。收集按照细胞分组转染48 h的各组细胞，消化后制成3×105cells/ml的细胞悬液。向小室上室内加入200 μl的细胞悬液，下室加入500 μl的含20%血清的培养基，将含有小室的24孔板置于细胞培养箱常规培养24 h。取出小室，擦去上室面未过膜细胞，甲醇固定下室面15 min，结晶紫染色后置于显微镜下观察并拍照，计算穿膜细胞数。每组设置3个复孔，实验重复3次。

1.8 Western blot检测P21、E-cadherin、MMP-2蛋白表达

细胞转染48 h时，收集细胞加入RIPA裂解15 min后提取细胞蛋白。BCA试剂盒测定蛋白浓度。取30 μg等量蛋白上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析细胞蛋白后，进行常规湿法转膜。5%脱脂牛奶室温封闭膜1 h，加入Ⅰ抗稀释液4℃孵育过夜。洗膜后，加入Ⅱ抗稀释液室温孵育1 h。洗膜后进行化学发光显色。以GAPDH为内参照，运用Imagel J软件分析目的蛋白的表达水平。每组设置3个复孔，实验重复3次。

1.9 双荧光素酶报告实验

采用targetscan进行靶基因预测显示miR-670-5p与WWOX之间可能存在相互作用，于是采用双荧光素酶报告实验进行验证。将miR-670-5p mimics、miR-NC分别与WT-WWOX或者MUT-WWOX共转染至A549细胞，转染48 h检测细胞荧光素酶活性变化。每组设置3个复孔，实验重复3次。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 miR-670-5p在肺癌组织和癌旁组织中的表达

图1显示，肺癌组织中miR-670-5p的表达水平较癌旁组织显著升高(P<0.05)。

Fig. 1 miR-670-5p expressions in lung cancer and adjacent tissues(n=28)*P<0.05 vs the paracancerous tissue group

2.2 抑制miR-670-5p对细胞A549细胞存活率的影响

表1和图2显示，与anti-miR-NC组比较，anti-miR-670-5p组A549细胞miR-670-5p的表达水平显著降低，P21蛋白的表达水平显著升高，细胞活力(48 h、72 h)显著降低(P<0.05)。

Tab. 1 Effects of miR-670-5p on cell viability in A549 n=9)

Fig. 2 Effects of miR-670-5p on cell viability and P21 protein expression in A549 cells (n=9)

2.3 抑制miR-670-5p对细胞A549迁移、侵袭的影响

表2和图3显示，与anti-miR-NC组比较，anti-miR-670-5p组A549细胞E-cadherin蛋白的表达水平显著升高，MMP-2蛋白的表达水平显著降低，迁移和侵袭细胞数目显著减少(P<0.05)。

Fig. 3 Effects of miR-670-5p on migration, invasion and protein expression of A549 cells

Tab. 2 Effects of inhibition miR-670-5p on migration and invasion of cells n=9)

2.4 miR-670-5p靶向调控WWOX表达

采用生物信息学分析工具targetscan进行靶基因预测发现，WWOX的3’UTR区域含有miR-670-5p的互补序列，见图4A。双荧光素酶报告实验显示，与miR-NC和WT-WWOX共转染组比较，miR-670-5p mimics和WT-WWOX共转染组A549细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；与miR-NC和MUT-WWOX共转染组比较，miR-670-5p mimics和MUT-WWOX共转染组A549细胞荧光素酶活性变化无统计学意义，见表3。Western blot检测显示，与miR-NC组比较，miR-670-5p组A549细胞WWOX蛋白的表达水平显著降低(0.09±0.01vs0.32± 0.03，P<0.05)；与anti-miR-NC组比较，anti-miR-670-5p组A549细胞WWOX蛋白的表达水平显著升高(0.67±0.06vs0.34±0.03，P<0.05)。以上结果提示miR-670-5p靶向调控WWOX表达。

Fig. 4 miR-670-5p targeted regulation WWOX expressionA： 3’UTR of WWOX contained miR-670-5p complementary sequence; B： miR-670-5p regulated WWOX protein expression

Tab. 3 Double luciferase report n=9)

2.5 抑制WWOX能逆转抑制miR-670-5p对A549细胞存活率的影响

表4和图5显示，与anti-miR-670-5p+si-NC组比较，anti-miR-670-5p+si-WWOX组A549细胞WWOX蛋白的表达水平显著降低，P21蛋白的表达水平显著降低，细胞存活率显著增加(P<0.05)。

Tab. 4 WWOX inhibition reversed the effects of inhibition miR-670-5p on A549 cell survival n=9)

Fig. 5 Inhibition of WWOX could reverse the effect of miR-670-5p on cell viability and P21 protein expression in A549 cells(n=9)

2.6 抑制WWOX能逆转抑制miR-670-5p对细胞A549迁移、侵袭的影响

表5和图6显示，与anti-miR-670-5p+si-NC组比较，anti-miR-670-5p+si-WWOX组A549细胞E-cadherin蛋白的表达水平显著降低，MMP-2蛋白的表达水平显著升高，迁移和侵袭细胞数目显著增加(P<0.05)。

Fig. 6 Inhibition of WWOX can reverse the effects of miR-670-5p on migration, invasion and protein expression of A549 cells

Tab. 5 WWOX inhibition reversed the effects of inhibition miR-670-5p on migration and invasion of cells n=9)

3 讨论

随着我国工业现代化的发展，肺癌发病率和死亡率快速上升，已成为危害人类健康的公共卫生问题。尽管目前肺癌临床诊疗水平取得一定进展，但其治疗效果并不显著。因此，找寻与肺癌进展有关的基因，开发新的分子靶向治疗策略对提高晚期肺癌患者的生存率有重要意义。

miRNAs是一类高度保守的内源性非编码短链RNA，在转录后水平参与对人类约60%基因表达的调控。近年来，越来越多的证据表明，miRNA通过调控癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等多种生物学过程，发挥癌基因或抑癌基因的功能[7，8]。miR-670-5p是最近发现的miRNA，目前关于miR-670-5p的报道仅有3篇。Shi等[6]对28例肝癌组织和与其对应的癌旁组织中miR-670-5p表达情况进行检测发现，至少60%的肝癌组织中miR-670-5p的表达较癌旁组织增加了三倍以上，抑制miR-670-5p表达可抑制肝癌细胞的增殖。Nolte E等[9]指出洋地黄毒甙及其类似物对肾细胞癌细胞的生长抑制以及G2/M细胞周期阻滞作用可能与下调miR-670-5p表达有关。然而，在食管鳞癌中miR-670-5p下调却促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭，这可能与miRNA表达组织特异性有关[10]。本研究采用RT-qPCR对28例肺癌组织和与其对应的癌旁组织中miR-670-5p的表达水平进行检测发现，肺癌组织中miR-670-5p的表达水平显著升高，提示miR-670-5p在肺癌中可能发挥癌基因作用。进一步研究发现转染anti-miR-670-5p后A549细胞中miR-670-5p的表达水平降低，提示转染效果较好。功能分析显示抑制miR-670-5p表达后A549细胞存活率、迁移侵袭能力显著降低。E-cadherin是维持上皮细胞极性和紧密连接的重要分子，MMP家族蛋白在肿瘤转移中参与对细胞质基质的破坏，E-cadherin表达减少和MMP表达增加是肿瘤侵袭转移的重要途径[11-13]。检测增殖、迁移侵袭相关蛋白表达发现，抗增殖蛋白P21、抗迁移侵袭蛋白E-cadherin的表达显著增加，促迁移侵袭蛋白MMP-2的表达显著降低。提示抑制miR-670-5p表达可显著抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，miR-670-5p是肺癌诊疗的潜在靶点。

为揭示miR-670-5p肺癌中的作用，采用生物信息学分析工具targetscan预测miR-670-5p的靶基因，发现miR-670-5p可能与WWOX之间存在相互作用。人WWOX基因定位于染色体上常见的脆性位点FRA16D，跨越1百万个碱基，包含9个外显子。研究显示WWOX在乳腺癌[14]、口腔鳞癌[15]等侵袭性肿瘤中经常表达下调，恢复WWOX表达可抑制肿瘤的生长。在肺癌中WWOX表达水平与肺癌侵袭性呈负相关，过表达WWOX可抑制高侵袭性肺癌细胞的活力和侵袭能力，抑制MMP-9表达，促进细胞凋亡[16]。此外，抑制miR-24通过靶向WWOX可抑制非小细胞肺癌细胞的恶性进展[17]。本研究显示miR-670-5p可直接与WWOX结合并抑制WWOX表达。于是推测miR-670-5p可能通过靶向WWOX参与肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。进一步研究显示干扰WWOX表达可逆转抑制miR-670-5p对A549增殖、迁移侵袭、以及P21、E-cadherin和MMP-2表达的影响。提示抑制miR-670-5p通过靶向WWOX抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭。

综上所述，miR-670-5p在肺癌组织中表达上调，miR-670-5p通过靶向WWOX可促进肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。miR-670-5p有望成为肺癌诊疗的分子靶点。