鳖甲育肝颗粒对复合因素所致肝纤维化大鼠TGF-β1/Smads通路的影响*

丁茂鹏， 韦凌霞， 王志旺， 程小丽， 庞亚蓉

(甘肃中医药大学, 兰州 730000)

在中医理论中，肝有“体阴而用阳”的生理特点与“阳常有余阴常不足”的病理特点，所以“体阴而阴不足”当属肝病的基本病机[1, 2]。在以上中医药理论的指导下拟定的鳖甲育肝颗粒具有软肝散积、育阴调肝之效，临床上对肝纤维化有明显疗效。慢性肝病发展至肝硬化过程中，肝细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的合成与降解失衡是肝纤维化发生的主要机制[3]。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)是促肝纤维化的关键因子，可通过Smads通路激活肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)而分泌细胞外基质，促进肝纤维化的发生与发展[4]。本实验在复制肝纤维化大鼠模型的基础上，研究鳖甲育肝颗粒对肝纤维化的治疗作用及对TGF-β1/Smads信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

甘肃中医药大学药理学教研室提供的鳖甲育肝颗粒(Biejia Yugan Granule, BYG)，由鳖甲、山茱萸、柴胡、黄芩等中药制成，批号：20181206；西双版纳版纳药业责任有限公司生产的秋水仙碱片(Colchicine)，国药准字：H53021369，批号：20190203。南京建成生物工程研究所生产的天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)；北京北方生物技术研究所生产板层素(laminin, LN)、Ⅲ型前胶原(Ⅲprocollagen, PCⅢ)、Ⅳ型胶原(type IV collagen, C-Ⅳ)以及透明质酸(hyaluronic acid, HA)ELISA试剂盒；武汉博士德生物工程有限公司生产TGF-β1抗体免疫组化试剂盒。其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

BI-2000型医学图像分析系统，成都泰盟科技有限公司产品；CFX型Peal-Time荧光定量PCR仪，美国伯乐公司产品；S1000TM逆转录仪，美国BIO-RAD公司产品；Chemi DOC XRS+凝胶成像分析系统，美国BIO-RAD公司产品；日本Olympus生产的CH-212型光学显微镜。

1.3 动物

SPF级SD大鼠，雌雄各半，体重200～230 g，中国农业科学院兰州兽医研究所生产，SCXK(甘)2015-0001为实验动物质量合格证。饲养在甘肃中医药大学实验动物中心，SYXK(甘)2015-0005为实验动物设施使用许可证。

1.4 造模、给药

将大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、秋水仙碱组(1.0×10-4g/kg)、鳖甲育肝颗粒各剂量组(1.85、3.70、7.40 g/kg，n=8)。结合预实验结果与文献[5]，采用灌胃乙醇并皮下注射四氯化碳的方法来复制大鼠肝纤维化模型，在每天灌胃5%乙醇15 ml/kg的基础上，每周皮下注射40%四氯化碳橄榄油2次，第一次5.0 ml/kg，以后各次3.0 ml/kg，连续造模6周。从造模开始灌胃给药，每日一次，连续给药6周。

1.5 取材、指标测定

实验第43日，大鼠称重、麻醉，股静脉取血后处死，手术摘取肝脏，称重，在固定位置取肝组织3份，第1份肝组织精密称重，干燥至恒重后再称重，计算含水量；第2份肝组织经多聚甲醛固定，切片经免疫组化染色，观测肝组织TGF-β1表达特点并进行半定量分析；第3份肝组织采用PCR法测定Smad3、Smad7基因表达水平。肝组织含水量(%)=[(湿重-干重)/湿重]×100%。

1.6 PCR法测定肝组织Smad3、Smad7基因表达

取大鼠肝组织加RNAico Plus于冰上匀浆，经提取、沉淀、洗涤等步骤得总RNA。紫外分光光度法测定其浓度后，在反转录反应体系中合成第一链cDNA，作为实时荧光定量RT-PCR分析的模板，检测目标基因Smad3、Smad7与GAPDH表达的荧光强度，以模型对照组为对照计算△△Ct，采用2-ΔΔCt法计算目标基因相对表达量，比较各组目标基因表达的差异性。引物为生工生物工程(上海)股份有限公司生产，Smad3(153 bp)：上游5'-CGTCCGATCCTCCCTTCAC-3'，下游5'-CCAAGCTCTTGCCCGCCTTC-3'；Smad7(276 bp)：上游5'-AACTGCAGACTGTGCAGACG-3'，下游5'-TTGGGAATCTGAAAGCCCCC-3'；GAPDH(217)：上游5'-GGCAAGTTCAACCGGCACAG-3'，下游5'-CGCCAGTAGACTCCACGACAT-3'。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 鳖甲育肝颗粒对大鼠肝脏组织形态学的影响

肝组织TGF-β1免疫组化染色后，高倍镜下空白对照组大鼠肝小叶结构完整、肝细胞排列整齐，期间偶有灰色TGF-β1表达，着色较浅；模型对照组大鼠肝小叶结构不完整，期间夹杂大量胶原纤维沉积，TGF-β1广泛表达于汇管区、纤维间隔及肝窦壁等细胞核周围的胞浆内，着色较深。在鳖甲育肝颗粒的干预下，大鼠肝小叶及肝细胞上述病理变化出现明显改善，TGF-β1的表达出现不同程度减轻(图1)。

Fig. 1 Effects of BYG on TGF-β1expression in HF rats (×40)A: Control group; B: Model group; C: Colchicine group; D: BYG-L group; E: BYG-M group; F: BYG-H group

2.2 鳖甲育肝颗粒对肝纤维化大鼠肝功能的影响

表1结果显示，与空白对照组比较，模型组大鼠血清中ALT、AST及ALP的活性显著升高(P< 0.01)。与模型组比较，秋水仙碱组和不同剂量鳖甲育肝颗粒干预组，ALT、AST及ALP的活性均显著下降(P<0.01)；与鳖甲育肝颗粒中剂量组比较，高剂量组大鼠血清中ALP活性显著下降(P<0.01)。

Tab. 1 Effects of BYG on liver functions in HF rats (U/L, n=8)

2.3 鳖甲育肝颗粒对肝纤维化大鼠肝指数及其含水量的影响

表2结果显示，与空白对照组比较，模型组大鼠肝组织含水量与肝指数显著升高(P<0.01)；秋水仙碱和不同剂量鳖甲育肝颗粒干预组大鼠肝组织含水量与肝指数均显著下降(P<0.01)。

Tab. 2 Effects of BYG on liver index and water content in HF rats (%, n=8)

2.4 鳖甲育肝颗粒对肝纤维化大鼠血清肝纤维化相关指标的影响

表3结果显示，与空白对照组比较，模型组大鼠血清HA、PCⅢ、C-Ⅳ及LN质量浓度均显著升高(P<0.01)；与模型组比较，秋水仙碱组和不同剂量鳖甲育肝颗粒干预组大鼠血清中HA、PCⅢ、C-Ⅳ及LN质量浓度均显著下降(P<0.01)。

Tab. 3 Effects of BYG on liver fibrosis related indexes in HF rats (μg/L, n=8)

2.5 鳖甲育肝颗粒对肝纤维化大鼠肝组织Smad3、Smad7基因表达的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠肝组织中Smad3与Smad7基因表达显著升高(P<0.01)。与模型组比较，秋水仙碱组和不同剂量鳖甲育肝颗粒干预组Smad3 mRNA表达明显下降，而Smad7 mRNA表达持续升高(P<0.01)；与鳖甲育肝颗粒中剂量比较，低、高剂量组差异有统计学意义(P<0.01，表4)。

Tab. 4 Effects of BYG on expressions of Smad3 mRNA and Smad7 mRNA in HF rats n=8)

2.6 鳖甲育肝颗粒对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1表达的影响

半定量分析显示，与空白对照组比较，模型组大鼠肝组织中TGF-β1表达水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较，秋水仙碱和不同剂量大鼠肝组织中TGF-β1表达的平均光密度值显著升高(P<0.01)。与模型组比较，秋水仙碱和不同剂量鳖甲育肝颗粒干预组TGF-β1表达水平显著下降(P<0.01)；与鳖甲育肝颗粒中剂量比较，低剂量组差异有统计学意义(P<0.01，表5)。

Tab. 5 Effects of BYG on TGF-β1 expression in HF rats n=8)

3 讨论

肝纤维化是肝脏对多种慢性损伤的修复过程中，肝组织细胞外基质(ECM)合成增加或降解减少、纤维组织大量沉积的病理过程。肝纤维化是慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段，肝脏病理学专家Hans Popper指出：“谁能阻止或延缓肝纤维的发生，谁就将治愈大多数慢性肝病”，因此缓解肝纤维化进程在整个肝病的治疗中有重要意义[6]。鳖甲育肝颗粒是在肝“体阴而阴不足”等中医理论的指导下配制的，由鳖甲、山茱萸、柴胡、黄芩等中药制成，具有育阴调肝、软肝散积的功效，临床上主要用于慢性肝炎之肝纤维化以及肝硬化的治疗[7]。四氯化碳、乙醇具有肝毒性，是目前常用的复制肝纤维化动物模型的化学药物，本次研究采用四氯化碳、乙醇来复制肝纤维化动物模型[8]。ALT、AST及ALP是评价肝功能的重要指标，ALT主要存在于肝细胞浆中，在肝内酶活性明显高于血清，因此，少量肝细胞坏死即可导致血清ALT水平明显增高；AST主要分布在肝细胞线粒体内，当肝细胞坏死，AST可从线粒体中释放出来，进而导致血清AST明显升高[9]；ALP升高是由于肝细胞受损、微胆管梗阻所致，故这些指标的含量可反映肝细胞的受损情况[10]。血清中HA，LN，C-Ⅳ和PCⅢ与肝纤维化程度密切相关，PCⅢ可反映肝Ⅲ型胶原的合成，并且血清含量与肝纤维化程度一致；Ⅳ-C是构成基底膜的主要成份，是反映基底膜胶原更新的灵敏指标；LN是基底膜总特有的非胶原性结构蛋白，与肝纤维化活动呈正相关；HA由间质细胞合成可较准确反映肝内生成纤维量及肝细胞受损情况，也是衡量肝纤维化的敏感指标[11, 12]。此外，研究表明慢性肝炎及肝纤维过程中，炎症反应可引起肝组织充血、水肿，而肝组织含水量也能间接反映肝组织炎症反应的程度[13]。本研究结果显示，在乙醇与四氯化碳的影响下，大鼠血清肝功能指标(ALT、AST、ALP)、肝纤维化指标(HA，LN，C-Ⅳ、PCⅢ)及肝组织含水量均显著升高，表明肝纤维化造模成功。在给予鳖甲育肝颗粒后，肝组织含水量及肝指数、血清ALT、ALP及AST含量均显著降低，HA、LN、C-Ⅳ及PCⅢ含量降低提示鳖甲育肝颗粒对肝纤维化有明显的降酶保肝作用。

TGF-β1是公认的最强致肝纤维化的细胞因子之一，TGF-β1/Smads通路是目前发现的最经典的参与肝纤维化的信号通路，主要由细胞膜外TGF-β1、膜上TβR受体与膜内Smads组成[14]。当肝脏受到外界刺激而发生损伤时，TGF-β1与细胞膜表面的TβRII结合，激活TβRI的丝氨酸/苏氨酸激酶，磷酸化后的TβRI激活Smad3并与Smad4形成转录复合物进入核内，调节靶基因的转录及蛋白质的合成，促进HSC转化并加速ECM的合成[15, 16]。Smad7是TβRI型受体丝氨酸/苏氨酸激酶的拮抗蛋白，Smad7与TβRI受体结合后可干扰Smad3的磷酸化，从而在TGF-β1/Smads信号转导中构成负反馈调节环路，抑制纤维化的发生与发展[17]。本研究发现，在鳖甲育肝颗粒的干预下，肝组织中TGF-β1、Smad3 mRNA的表达水平下调，而Smad7 mRNA的表达上调，提示抑制TGF-β1/Smads信号通路是鳖甲育肝颗粒抗肝纤维化的作用机制之一。