橘皮素对高强度运动诱发的人体皮质醇应激反应的影响*

刘 猛, 莫仕围, 周志钦, 高炳宏△

(1. 上海体育学院体育教育训练学院, 上海 200438； 2. 深圳大学体育部, 深圳 518060； 3. 西南大学园艺园林学院, 重庆 400700)

皮质醇应激反应(cortisol stress responses)对维持人体的正常生理功能至关重要，当人体感知到外部压力时，会刺激下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary adrenal, HPA)轴加速分泌皮质醇，提升血液内糖脂物质浓度，激活糖异生，促使人体做好“战斗或逃走”准备[1]。频繁的高强度刺激(如，剧烈运动)或持续的低强度压力(如，疲劳、压抑)会导致血液皮质醇浓度的长期慢性增加，进而可能诱发肌肉萎缩、过敏性疾病、抑郁症、库欣式综合征等疾病[2]。研究指出,通过补充相关营养补剂能有效调控皮质醇应激反应，抑制皮质醇过度分泌[3,4]。其中，天然果蔬补剂，如，橘皮素补剂，因其绿色天然、无违禁物质及低毒副作用等优点，已受到越来越多的关注。

橘皮素(tangeretin)属于多甲氧基黄酮(polymethoxylated flavones, PMFs)，它是类黄酮家族的关键成员，也是柑橘类水果特有的多甲氧基黄酮单体化合物之一。其主要分布于橙、柑、柚、橘等4类水果的皮或茎，具有良好的抗癌、抗炎、抗氧化和预防心血管疾病等活性功能[5]，而且，还可有效预防剧烈运动诱发的心肌损伤和呼吸道疾病[6]。与其它黄烷酮单体相比，橘皮素口服利用率高，安全性好，无兴奋剂违禁物质，非常适合高水平职业运动员使用。团队前期关于橘皮素应用于运动领域的探索性研究发现：橘皮素能显著提高昆明鼠的运动耐力，明显减轻力竭运动诱发的氧化应激伤害[6]；举重运动员口服5周橘皮素(200 mg/d)后，主观疲劳感明显消除，清晨安静状态下的血清皮质醇水平显著下降[7]。这些研究结果均提示，橘皮素可能有助于缓解运动疲劳，抑制皮质醇过度分泌。

高强度运动产生的应激压力会引发明显的皮质醇反应，刺激HPA轴分泌大量皮质醇，进而抑制蛋白质的合成代谢，延缓身体机能恢复，最终对运动表现产生不利影响[8]。在高强度运动过程中，橘皮素能否缓解高强度运动激发的皮质醇应激反应，抑制皮质醇过度分泌，目前仍不明确。因此，本研究目的是以高强度抗阻运动激发试验为手段，分析橘皮素对运动员皮质醇应激反应的影响。本研究的假设是，4周橘皮素补充能缓解高强度抗阻运动引发的皮质醇应激反应，适度降低血清皮质醇水平。研究结果将有助进一步认识橘皮素在皮质醇应激反应过程中的调控作用，为研发新型运动补剂帮助缓解运动员剧烈运动后的疲劳提供依据。

1 对象与方法

1.1 受试者

本研究从重庆市田径运动管理中心招募24名短跑运动员，男女各12名，运动等级均为国家二级及以上，年龄(22.7±1.1)岁，身高(174.9±6.9)cm，专业抗阻训练年限(5.6±1.2)年。纳入本研究前，全部运动员均经过系统的医学检查，以排除患有心血管疾病、抑郁症、库欣综合征及近五年曾患重大疾病者。运动员详细了解本研究的内容、流程及潜在风险后，签署知情同意书。本研究方法严格遵守了《赫尔辛基宣言》并取得上海体育学院学术与伦理委员会批准。

1.2 分组

本研究采用配对、随机、双盲实验设计。首先，按照性别、体型和运动水平等，将全部运动员进行两两配对；然后，随机分入试验组(身高(172.19± 4.67)cm，体重(61.23±6.08)kg，年龄(23.30± 3.39)岁)和对照组(身高(175.20±8.88)cm，体重(59.73±9.41)kg，年龄(22.10±2.76)岁)，两组均为6男6女，身高、体重及年龄无组间差异。除文章第一作者外，其余研究人员及全部运动员均不知晓分组、橘皮素/安慰剂分配情况。试验组和对照组均按要求完成补剂干预试验和运动激发试验。

1.3 补剂干预试验

本研究要求全部运动员每天7:30-8:30 am进入实验室，按编号现场领取并口服冲兑好的橘皮素补剂或安慰剂，全程由研究人员监督完成。试验组服用清果人®橘皮素补剂，为每袋20 g(分离乳清蛋白粉19.8 g，纯度95%；橘皮素200 mg，纯度 99.79%；中国反兴奋剂中心检测报告编号：2019FD234)；对照组服用安慰剂，为分离乳清蛋白粉，每袋20 g(纯度95%，中国反兴奋剂中心检测报告编号：2019FD279)。两组均每日服用一袋(20 g)，持续4周，中间无间断。干预期间，全部运动员周一至周六正常参与运动训练，周日休息。

1.4 运动激发试验

全部运动员分别在补剂干预试验前1日和补剂干预试验后次日各进行一次高强度抗阻运动激发试验(图1B)。参照相关研究[3,9]，本研究激发试验选取推举、深蹲、卧推和硬拉等4个抗阻动作，并按上述顺序依次完成。每个动作完成4组，每组10RM (repetition maximum, RM)；每个动作或组之间的休息时间均为2 min。10RM值为每个动作可以重复10次的最大力量，即，10RM(kg)=(1.139RepWt+ 0.352Reps+0.243)×20%(RepWt为多次重复的负重，Reps为至疲劳的重复次数)[3]。运动激发试验之前24 h，全部运动员在研究人员的指导下进行一次模拟训练，并计算和记录每名运动员4个抗阻动作的10RM值。激发试验前24 h内，要求所有运动员不能进行中高强度运动。

Fig. 1 Subject grouping and experimental designA: Subject grouping； B: Experiment procedure； C: Resistance exercise test

本研究分别在两次运动激发试验前即刻(PRE)和试验后再次采集血液样本(图1.B)，采样时间为2:00-5:00 pm，每次抽取静脉血3 ml(A管样本1 ml；B管样本2 ml)；其中，运动激发试验后采集4个时间点的血样：试验后即刻(P0)、第10分钟(P10)、第20分钟(P20)和第30分钟(P30)(图1.C)。采集的A管样本在10 min用血液细胞分析仪(迈瑞 BC-5150，中国)测试WBC水平；采集的B管血样在30 min内用高速离心机(蜀科TG16，中国)分离出血清样本(2 000 r/min,15 min)，保存于 -80℃医用冰箱(博科BDF-86V158，中国)。实验结束，由一名研究人员进行统一分析(迈瑞SAL-6000，中国；BioTek-Epoch，美国)，记录血清皮质醇、超氧化物歧化酶(SOD)、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)、白细胞计数(WBC)和血糖(Glu)结果。另外，分别在两次运动激发试验的PRE和P0时间点，使用便携式血乳酸仪(EKF，德国)测量每位运动员的血乳酸值。

研究期间，所有运动员的饮食(包括零食、水果等)均由重庆市竞技体育训练中心运动员餐厅统一提供；期间，研究人员对食材的选择、烹制等给予指导和监督，排除可能影响研究结果的食材及佐料[10]。此外，为排除其它因素干扰，补剂干预前2周至补剂干预后次日，共计43 d，所有运动员禁止补充除指定运动饮料(佳得乐)之外的其它任何补剂(包括中药材等)。整个研究过程中，全部运动员均未出现任何不适症状。

1.5 统计学处理

通过SPSS 25.0软件进行统计学分析，结果以均值±标准差表示。采用双因素(2个组别×不同时间点)重复测量方差分析运动员4个抗阻动作的10RM值(推举、深蹲、卧推和硬拉)及皮质醇应激反应的各项生化指标(血清皮质醇、SOD、ACTH、WBC、Glu和血乳酸)。如有显著性差异，在LSD标准的基础上进行两两比较。

2 结果

2.1 补充橘皮素4周对抗阻动作10RM值和血乳酸的影响

试验组与对照组4周补剂干预试验前后4个抗阻动作(推举、深蹲、卧推、硬拉)的10RM值可见表1。干预前后，两组之间均无统计学差异；两组的10RM值虽在4周干预后均有小幅增加，但无统计学显著性。

Tab. 1 Comparison of 10RM of the shoulder press, back squat, bench press and deadlift (kg, n=12)

4周干预前后，试验组与对照组的血乳酸值无显著性差异；在首次和第二次运动激发试验后，试验组与对照组的血乳酸值均显著增高(表2)。

Tab. 2 Comparison of blood lactate before and after resistance exercise test (mmol/L, n=12)

2.2 补充4周橘皮素及高强度抗阻运动对血清皮质醇、SOD、ACTH、WBC和Glu的影响

由表3可见，首次运动激发试验时，试验组与对照组之间的血清皮质醇、ACTH及SOD均无统计学差异。4周补剂干预后，试验组的血清皮质醇在运动激发试验的PRE(P=0.017)、P10(P=0.010)、P20(P=0.014)和P30(P=0.007)均显著低于4周补剂干预前的对应值，且在PRE(P=0.036)和P10(P=0.031)明显低于同期对照组；此外，试验组的ACTH在P10(P=0.037)和P30(P=0.049)均明显下降，且在P30(P=0.044)显著低于同期对照组；试验组的SOD活性水平在P30(P=0.044)显著高于同期对照组。

Tab. 3 Effects of high-intensity resistance exercise on sreum cortisol, ACTH and SOD before and after 4-week intervention n=12)

由表4可见，4周补剂干预后，试验组的WBC在运动激发试验的PRE(P=0.037)和P30(P= 0.046)显著低于4周补剂干预前的对应值，且在P20(P=0.01)和P30(P=0.003)显著高于同期对照组；另外，两组运动员的血糖水平在干预前后及两组之间均无显著性差异。

Tab. 4 Effects of high-intensity resistance exercise on Glu and WBC before and after 4-week n=12)

3 讨论

本研究旨在探讨4周橘皮素补充对高强度抗阻运动诱发的皮质醇应激反应的影响。与本研究假设一致，我们发现，试验组运动员补充橘皮素4周(每天200 mg)后，血清皮质醇水平显著下降，且在高强度抗阻运动刺激后，血清皮质醇水平也明显下降；同时，与同期对照组相比，血清皮质醇水平更低。本研究还发现，试验组运动员补充橘皮素后，ACTH和WBC水平显著下降，且低于同期对照组；SOD活性水平高于同期对照组；血糖水平无明显变化。鉴于高强度抗阻运动可激发人体的皮质醇应激反应，迅速提升体内皮质醇水平[3,9,11]本研究结果提示：高强度运动时辅以补充橘皮素有助于调控皮质醇应激反应，抑制机体过量分泌皮质醇，同时，还可改善机体抗氧化能力，加速体内炎症消除，且不会对糖脂代谢供能产生负面影响。

多项研究[3,7,12]已证实，类黄酮能有效调控皮质醇应激反应，抑制机体合成分泌皮质醇，如，健康受试者在进行社会压力测试前的2 h内食用50 g黑巧克力(含总类黄酮600 mg)能有效抑制皮质醇应激反应，明显降低体内皮质醇水平[12]。橘皮素为PMFs，属于类黄酮亚族。本团队前期相关研究发现，橘皮素对机体调控皮质醇水平能产生积极作用，如，举重运动员连续口服橘皮素(200 mg/d)5周后，清晨空腹血清皮质醇水平显著下降[7]。由于该研究[7]未能较好地控制运动员饮食以及其它补剂补充情况，此次，本研究严格把关试验设计并增加试验对照组，发现：短跑运动员连续4周补充橘皮素(200 mg/d)后，血清皮质醇水平在运动激发试验后恢复期的第10(P10)、20(P20)和30(P30)分钟均显著下降，且在P30时显著低于同期对照组短跑运动员。以上均提示：作为类黄酮亚族成员之一的橘皮素对机体的皮质醇调控起到了积极的作用，能帮助缓解皮质醇应激反应。Kraemer等[3]发现，运动员连续4周补充混合类黄酮补剂后，高强度抗阻运动激发的皮质醇应激反应得到显著缓解，运动后血清皮质醇水平的恢复速度更快。Kraemer等认为，补剂中的槲皮素起关键作用，因为槲皮素可限制人体肾上腺皮质癌细胞(H295R)内11β-羟基类固醇脱氢酶(11-βHSD)的mRNA基因表达，进而抑制17羟11脱氢皮质酮(可的松)向皮质醇转化，从而避免机体过量分泌皮质醇。Hasegawa等[13]通过佛司可林激发实验也发现，柚皮苷(30 μmol/L)或橙皮素(10 μmol/L)均能有效降低3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)活性，进而明显降低可的松水平；Ohno等[9]也指出，M6-羟基黄酮(0.5～2.7 μmol/L)能抑制细胞色素P450酶与3β-HSD的活性，进而使H295R细胞合成分泌皮质醇的量显著下降。上述槲皮素、柚皮苷、橙皮素和M6-羟基黄酮均属于PMFs。橘皮素与这4种物质一样同属PMFs，且化学结构和活性功能均高度相似[5]。因此，橘皮素是否通过相似途径(抑制11-βHSD的基因表达，降低细胞色素P450酶和3β-HSD的活性)来调节机体皮质醇的合成与分泌，进而调控皮质醇应激反应，有待进一步试验论证。

另外，类黄酮还可通过影响ACTH来间接影响机体的皮质醇应激反应。ACTH可调节机体合成分泌皮质醇，应激条件下，下丘脑会加速分泌ACTH，进而促进机体合成分泌大量的皮质醇。An等[13]报道，喂食4周小补心汤(总类黄酮含量：50 mg/(kg·d))后，实验鼠的ACTH和血清皮质醇水平均显著下降。其认为类黄酮会通过抑制ACTH分泌，进而降低机体皮质醇水平。Kraemer等[3]发现，实验组运动员连续4周口服混合类黄酮补剂(含槲皮素)后，ACTH值显著低于同期对照组，且实验组运动员在高强度抗阻运动激发试验后第5和10分钟这2个时间点的ACTH值显著低于补剂干预前。Kraemer等[3]还观察到，试验组运动员的血清皮质醇的变化趋势与ACTH高度一致。本研究观察到相似的结果，试验组运动员补充4周橘皮素后，ACTH呈现与血清皮质醇一致的变化趋势，即，高强度运动激发试验后恢复期的第10(P10)和30(P30)分钟这2个时间点显著下降，且在P30时显著低于同期对照组。

补充天然抗氧化剂产物能有效清除剧烈运动时产生的大量自由基，可促进疲劳消除，进而降低血清皮质醇水平[14-16]。作为一种天然果蔬抗氧化剂，橘皮素的抗氧化能力已得到有效验证：基于细胞模型的研究[17]发现，橘皮素能显著减少过氧化氢叔丁基(t-BHP)诱发的HepG2细胞氧化损伤，加速自由基清除效率；基于动物模型的研究[6]发现，给小鼠连续补充4周橘皮素(50 mg/(kg·d))后，其体内抗氧化酶活性明显增强，因高强度力竭运动造成的心肌与骨骼肌氧化应激损伤得到明显缓解。本研究中，试验组运动员在补充橘皮素4周后再次进行高强度抗阻运动激发实验时，体内SOD活性水平保持稳定，而对照组运动员体内的SOD活性呈下降趋势，且显著低于同期试验组。结合不同层面(细胞、动物、人体)的相关研究结果，可以推断：橘皮素具有良好的抗氧化能力。因此，高强度运动时辅以补充橘皮素可能有助提升运动员机体的抗氧化能力，间接抑制其合成分泌皮质醇，最终缓解皮质醇应激反应。

除此之外，多项研究[5,7,18]指出，橘皮素还具有抗炎和免疫调节活性功能(如，降低促炎性细胞因子TNF-α水平，增强抗炎细胞因子IL-1α活性)。高强度抗阻运动产生的强力刺激会引发体内一系列免疫反应变化，导致炎症因子(如，WBC)大量增加，进而可能增加机体损伤风险及延长恢复时间[19]。本研究中，两组运动员在抗阻运动激发试验后即刻(P0)，WBC水平均大幅升高，之后的恢复期(P10、P20、P30)逐渐下降，这与Athanasios等[19]的结果基本一致。但是，本研究还发现，试验组运动员的WBC下降率明显大于对照组。这提示：运动员口服橘皮素补充不仅不会损害机体抗炎能力，反而能降低高强度抗阻运动后体内的WBC水平，可能有利于肌肉等组织的修复再生、机能恢复。供能物质(如，血糖)在运动时同样非常重要。运动时，皮质醇分泌促进肌糖原或肝糖原分解，有助维持或提升机体血糖水平[20]。本研究中，两组运动员的血糖水平在抗阻运动激发试验后即刻(P0)均上升，在之后的恢复期逐渐下降，虽然试验组运动员的血糖水平下降幅度略大，但两组之间并无统计学差异。这可能说明：补充橘皮素不会明显影响运动员的血糖水平，对其糖脂代谢供能系统不会产生消极影响。

综上所述，本研究以高强度抗阻运动作为诱发人体皮质醇应激反应的手段，探讨了橘皮素补充对人体皮质醇应激反应的影响。研究发现，为期4周橘皮素补充(200 mg/d)可有效缓解高强度抗阻运动激发的皮质醇应激反应，降低血清皮质醇和ACTH水平，提升人体的抗氧化和抗炎能力，同时，不会对机体糖脂代谢产生负面影响。考虑到全部运动员在服用橘皮素期间无任何生理或情绪不良反应(如，失眠、恶心、烦躁等)，橘皮素可被用于研发运动补剂来辅助运动员竞赛训练，尤其对于短跑、举重等高强度抗阻运动项目具有重要价值。