海拔高度对2型糖尿病患者循环内皮祖细胞及低氧诱导因子的影响*

陆润兰， 李 萍， 李 兵， 邢 媛， 张媛媛， 陈斌泽， 胡秦妮， 杨志华， 高保东，哈小琴， 高彩燕△

(1. 兰州市中医医院， 兰州 730050; 2. 联勤保障部队第九四〇医院， 甘肃省干细胞与基因药物重点实验室， 兰州 730050)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一种以高血糖和胰岛素抵抗为主要特征的慢性代谢性疾病。研究显示，高原地区2型糖尿病患者血液学指标发生改变，易发生血管病变[1]。循环内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)作为血管内皮细胞的原始细胞对血管的修复以及个体的整个生命周期都起着至关重要的作用。研究显示，T2DM患者随着血管并发症的加重，循环EPCs数量降低，功能发生异常[2]。而且随着海拔的升高，HIF-1α表达增加，循环EPCs数量降低[3]。但目前仍不清楚不同海拔下T2DM患者外周血循环EPCs的数量变化和HIF-1α的表达情况。据此，本文将对不同海拔下T2DM及并发症患者外周血EPCs和HIF-1α的变化进行分析，从而为高海拔地区T2DM患者血管并发症的治疗提供依据。

1 对象与方法

1.1 对象

选取长居海拔386 m的陕西省咸阳市某医院的2型糖尿病患者25名，健康者20名，作为低海拔组；选取长居海拔1 520 m的甘肃省兰州市某医院的2型糖尿病患者29名，健康者20名，作为高海拔组。纳入排除标准：2型糖尿病患者以2003年世界卫生组织 T2DM诊断标准为依据，排除糖尿病合并心脑血管疾病、肝脏、肾脏、呼吸系统疾病，以及近期手术、炎症、肿瘤、外伤、溃疡病等影响EPCs的患者；健康对照组分别来自该院同期健康体检无任何异常者。

1.2 体格检查

对纳入对象均测量血压、身高、体重、腰围和臀围，并计算体质指数(body mass index, BMI)和腰臀比(waist to hip ratio, WHR)。

1.3 实验室检测

(1)生化指标检测 采集受试者5 ml静脉血，进行临床常规生化检测。

(2)循环EPCs的检测 取受试者200 μl抗凝全血，加入异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记的人CD45单克隆抗体，碱性磷酸酶(alkaline phosphotase，AP)标记的人CD34单克隆抗体和藻红蛋白(R-Phycoerythrin, PE)标记的人 VEGFR-2(KDR)单克隆抗体各5 μl，再加入别藻蓝蛋白(Allophycocyanin, APC)标记的IgG和PE标记的IgG单克隆抗体来做同型对照荧光补偿。25℃避光孵育30 min。后加入7 ml红细胞裂解液，避光分解20 min，裂解完全后以1 500 r/min转速离心5 min，弃去上清，加磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)液洗涤2次(每次2 ml)，全部转入BD流式管中离心5 min，弃上清，加入500 μl PBS制成单细胞悬液。最后在流式细胞仪上检测每个样本中CD45，CD34和VEGFR-2(KDR)双阳性的细胞即为EPCs，并以1×106单位进行计数。

(3)HIF-1α的浓度检测 血清中HIF-1α浓度采用ELISA方法检测，严格按照试剂盒操作说明书进行。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 基本信息

两地共纳入糖尿病者54人，健康者40人，男女各半，均为汉族，年龄为(59.5±9.9)岁。其中T2DM患者按照有无血管并发症分为T2DM无血管并发症组，T2DM大血管并发症组以及T2DM微血管并发症组。不同海拔地区研究对象基本信息详见表1。

Tab. 1 General situation of included objects in different altitude groups[n(%)]

2.2 不同海拔下T2DM组和健康组检测指标分析

如表2，3所示，无论高、低海拔地区，糖尿病组较健康组的BMI、WHR、GLU、HbAlc、TG均升高，而LDL降低，差异均具有统计学意义(P<0.05)；EPCs数量也较健康组减少(P<0.01)，提示糖尿病患者较健康者脂含量和糖含量较高，血管损伤修复的能力不如健康者；HIF-1α水平高海拔组较低海拔组明显增高(P<0.05)，低海拔糖尿病患者和健康者之间的差异无统计学意义(P>0.05)，这说明高海拔下机体缺氧程度高于低海拔，而高海拔T2DM缺氧较健康者更为严重。

Tab. 2 Analysis of the detection indexes and the number of EPCs in type 2 diabetes and healthy groups in low altitude areas

Tab. 3 Analysis of the detection indexes and EPCs of type 2 diabetes and healthy groups in high altitude areas

2.3 不同海拔下血糖控制好坏状况对T2DM组循环EPCs的数量的影响

如表4所示。血糖控制良好者空腹血糖较血糖控制较差者低(P<0.05)；循环EPCs数量较高(P<0.05)。提示血糖控制良好者较控制较差者，体内糖毒性引起血管损伤的程度更低，血管的修复能力更强。因此严格的控制血糖对于血管的修复具有重要意义。

Tab. 4 The effects of high and low altitude blood glucose control on the number of circulating EPCs in T2DM patients

2.4 不同海拔下各T2DM血管并发症组和健康组循环EPCs的数量变化情况

如图1所示，低海拔组的健康者、T2DM无血管病变者、T2DM大血管病变者和T2DM微血管病变者循环EPCs数量均高于高海拔组，且差异具有统计学意义(P<0.05)，这提示高海拔缺氧环境下，EPCs的动员能力或细胞的存活能力下降；其循环EPCs数量由高至低依次为健康组、T2DM无血管并发症者、T2DM微血管并发症者，T2DM大血管并发症者与T2DM微血管并发症者无差别，即除T2DM大小血管病患者之间循环EPCs数量差异无统计学意义外(P>0.05)，其他各组之间两两比较均具有统计学意义(P<0.05)。此结果同样提示随糖尿病并发症的加重体内可动员的EPCs数量或存活的数量逐渐降低，对于血管的修复能力也逐渐降低。因此EPCs的数量与海拔和疾病的严重程度密切相关。

Fig. 1 Changes in the number of Log(EPCs) between groups ofhigh and low altitude groupsA: Healthy group; B: T2DM without avascular disease group; C: T2DM macrovascular disease group; D: T2DM microvascular disease group*P<0.05 vs low altitude group

3 讨论

T2DM的大小血管并发症因起病隐匿，发生率高，而患者知晓率，诊断率和治疗率低，危害性大等特点，使得血管并发症致残或致死的发生率亦在逐年上升[4]。研究显示，糖尿病患者的胰岛素抵抗和高血脂高血糖状态对EPCs的增殖、分化、归巢及整合入血管的所有功能均有损害[5]。因此对于EPCs的测定可在一定程度上反应糖尿病并发症的进展情况。EPCs目前的测定方法较多，本文采用流式细胞仪进行数量的测定，能够更加灵敏和特异性的量化循环EPCs的数量。

本研究结果显示糖尿病组较健康组循环EPCs数量减少，且与并发症的严重程度成正相关。这可能与以下几种机制相关。第一，糖尿病患者长期处于高糖状态，从而诱发(advanced glycation end products，AGEs)的产生增加，抑制了EPCs的数量，影响其功能[6]。第二，高糖会使内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的活性降低，从而使NO的分泌减少，影响血管功能和EPCs的生成。相关的研究已证实高糖状态会抑制PI3K/Akt/eNOS通路的表达，从而影响NO的合成来影响EPCs的动员[7],而且NO还能通过多种途径来影响EPCs的动员，影响血管的生成。而在其通路调节的任何一个环节都有可能影响着EPCs的数量和功能[8]。第三，高糖引起氧化应激增强，活性氧产生增加，加速EPCs的衰老[9]，且会增加EPCs的自噬和凋亡，使细胞数量减少[10]。但糖尿病患者因自噬导致EPCs数量减少的具体通路还未完全探明，还需进一步证实。

此外，本研究也发现高海拔地区较低海拔地区而言，研究对象血循环EPCs减少。这为高海拔地区糖尿病患者进行EPCs移植进行治疗成为可能。因随海拔的升高，机体缺氧加重，氧化应激增强，出现血红素加氧酶表达降低，引起EPCs衰老和功能障碍[11]。在急性缺氧的情况下，EPCs会大量移植到外周血，组织血运重建；在慢性缺氧的情况下，HIF-1α会代偿性的高表达刺激下游因子血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，基质细胞衍生因子(stromal cell derived factor-1，SDF-1)，血管生成素1/2(angiopoietin1/2，ANGPT1/2)等多种血管生成因子的表达，来促进组织对缺氧的反应，修复血管内皮损伤[12]，而被激活的ANGPT又进一步增强EPCs的增殖和迁移，从而导致排列良好的内皮细胞结构和细胞间连接的血管增大，促进血液灌注[13]。Zhou[14]的研究也证实HIF-1α还可直接参与低氧诱导的EPCs增殖，迁移和分化。而且Zan[15]也提出了HIF-1α调控EPCs的两种途径，一方面HIF-1α通过SDF-1 / CXCR4轴促进EPCs动员和归巢，来增加外周血中的EPCs数量，助力新血管形成。另一方面，它可以通过刺激VEGF，成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)等的表达来改善EPC的血管生成功能，而此时迁移能力与外周血中的细胞数量是相反的，这就可以很好地解释为什么高海拔或者并发症严重的时候，HIF-1α表达增强而EPCs的数量降低了。因为进入失代偿阶段后，HIF-1α表达不断增强，刺激着EPCs的迁移，但EPCs动员减少或存活下降，没有有效的归巢，受损的血管得不到很好的修复，使其血管病变加重[16]。

此外本研究还发现血糖控制良好的患者较血糖控制较差的相比循环EPCs数量较高，这与Churdchomjan等人[17]的研究结果相一致，这也在一定程度上说明只要很好地控制血糖将在并发症的预防和预后中起到重要作用。但这只是从横断面水平研究的结果，仍需要进行队列研究来证明控制血糖控制良好是否能够改善外周EPCs进而预防血管并发症。

总之，本研究结果提示T2DM患者与健康者相比循环EPCs数量减少且与疾病程度相关；高海拔地区较低海拔地区人群循环EPCs数量显著减少，HIF-1α高度表达。这将为高海拔地区T2DM患者进行EPCs移植，缓解糖尿病并发症提供依据。