薏苡叶和淫羊藿配伍对小鼠抗疲劳及耐缺氧的作用*

赵士博， 黄锁义， 潘 智， 彭晓敏， 彭晓靖， 伍世娟， 韦德智， 陈新鹏

(1. 右江民族医学院临床医学院， 广西 百色 533000； 2. 右江民族医学院广西高校右江流域特色民族药研究重点实验室， 广西 百色 533000； 3. 右江民族医学院药学院， 广西 百色 533000)

薏苡(Coix lachryma-jobi L.)为禾本科(Gramineae)薏苡属(Coix L.)草本植物，别名薏仁、六谷子、珍珠米。现代研究表明薏苡可预防高血脂、高血压、中风、抗癌、美肤养颜、降血糖、增强免疫等多种药理作用[1]。因其极具营养滋补保健价值而备受青睐，广西作为薏苡主产区，对薏苡的研究与开发尚不完全[2，3]。经黄凯玲等[4]学者研究，薏苡叶提取物具有体外抗活性氧自由基作用进而可发挥体外抗氧化之功效，梁寻杰等经研究证实薏苡叶具有抗缺氧耐疲劳作用[5]。淫羊藿是中国传承千年的草药，因其具备防治骨质疏松、抗抑郁、抗哮喘及抗老年痴呆等功效，在方剂中多作为君药使用。现代药理研究证实，淫羊藿主含淫羊藿苷、淫羊藿多糖[6-8]，张红旭等[9]学者经研究表明，淫羊藿多糖是抗疲劳耐缺氧的有效成分。综上，两种药材均具有抗氧化抗疲劳耐缺氧的药理作用。

薏苡叶与淫羊藿单味药研究与应用广泛，明代大型方书《普济方》诸痹门中首次将两味中药配伍用以治疗腰脚寒痹，筋挛麻急，偶伴疼痛，行履不得。二者均归肾经，通过补肾阳提高其贮精纳气之功效，协调呼吸及其他运动。中医观点认为机体内的精气、血、津液缺失进而导致疲劳,通过辨证组方进行调治。在对中医方剂与现代药理学研究的基础上，本研究以昆明种小鼠为实验对象，探讨薏苡叶和淫羊藿及其配伍抗疲劳耐缺氧效果及二者配伍是否具有复合作用。为薏苡叶和淫羊藿药理作用的深入研究与开发及应用提供理论依据，阐明薏苡叶和淫羊藿的作用效果和联合应用的疗效，为临床开发的抗缺氧耐疲劳类药物提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与耗材

TWCL-T 5000磁力搅拌器，上海标和仪器有限公司；DLSB-5低温冷却液循环泵，郑州长城科工贸有限公司；JSC电子天平秤CN-BH，福州科迪电子技术有限公司；FA1204B电子天平，上海精科天美仪器有限公司；JMF-320G多级闪蒸器，河南智晶生物科技股份有限公司；清洁级实验鼠维持饲料，江苏省协同医药生物工程有限责任公司出品。

1.2 实验动物

SPF级昆明种小鼠，由广西百色市右江民族医学院实验动物中心提供，许可证号:SCXK桂2012-0003。本实验用鼠雌雄参半，体质量18～22 g，周龄不详。

1.3 药材的鉴定与提取

干燥的壮药材薏苡叶和淫羊藿采购于广西百色市西林县，粉粹后备用。经右江民族医学院科学实验中心主任黄锁义教授鉴定，确认为禾本科植物薏苡Coix lacryma-jobi L.的干燥叶和三枝九叶草Epimedium sagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.的干燥叶。

参照梁寻杰等[10]的方法制备薏苡叶提取液，干燥薏苡叶500 g用10倍蒸馏水浸泡1 h，煮沸30 min，自然冷却至室温后过滤。然后浓缩至100%(1 ml含生药1 g)，作为原药液，置于4℃冰箱保存备用，实验前再配制成浓度为1 g·ml-1的药液。

参照鲁静等[11]学者的提取方法，取淫羊藿药材500 g，加入无水乙醇(4倍体积) ，90℃提取140 min，提取3次后过滤，加入无水乙醇(4倍体积)摇匀，4℃放置12 h后以4 000 r·min-1离心20 min，弃去上清液，沉淀用蒸馏水配置为浓度1 g·ml-1，4℃冷藏备用，实验前配制成浓度为1.5 g·ml-1的药液。

1.4 动物分组及给药

240只SPF级昆明种小鼠，每个实验60只，各组小鼠依性别1∶1分笼随机分配，每组10只。5%苦味酸标记，采用随机数字表法分为6组:空白对照组、薏苡叶组、淫羊藿组、薏苡叶淫羊藿配伍低剂量组、薏苡叶淫羊藿配伍中剂量组和薏苡叶淫羊藿配伍高剂量组(以下简称低剂量组、中剂量组和高剂量组)，3个剂组分别以薏苡叶和淫羊藿1:1浓度比配置成1.5，4.5，7.5 g·kg-1·d-1三种浓度的药液备用。

实验动物经1周适应性喂养后测定体质量。为保证灌胃剂量的准确与实验严谨性的保证，实验期间每3 d测定一次小鼠体质量。实验中各组均按体质量20 ml·kg-1给予对应药液，即剂量为20 g·kg-1，空白对照组即生理盐水组，按等体积给予0.9%生理盐水。所有实验组每24 h灌胃一次，连续21 d。每次动物实验均遵守动物实验伦理要求。

1.5 小鼠负重游泳实验

取小鼠60只，雌雄比例、分组、给药及体质量测定按计划进行。末次灌胃30 min后在各组小鼠于尾部负重(小鼠体重7%)铁丝，每桶2只放于塑料桶内，水深28 cm(超过小鼠尾长和体长为宜)，水温控制在(30±2)℃。拨动水面使小鼠不断游动，记录小鼠自入水至头部6 s不能浮出水面的时间，即为小鼠力竭游泳时间。记录好时间后，捞出小鼠。

1.6 小鼠爬杆实验

取小鼠60只，雌雄比例、分组、给药及体质量测定按计划进行。末次给药30 min后进行爬杆实验。将小鼠放到玻璃棒顶，使肌肉处于静力紧张状态，记录小鼠由于肌肉疲劳从玻璃棒上跌落下来的时间，共测量3次取其均值作为爬杆时间。

1.7 小鼠耐常压缺氧实验

小鼠60只，按雌雄比例分组、给药及体质量测定按计划进行。第21日灌胃30 min后将一只小鼠放入50 ml 广口瓶中，瓶口用凡士林涂抹并盖严，记录并观察小鼠呼吸停止时间，即为小鼠常压耐缺氧时间。将小鼠剖腹，分离其肝脏称重，记录每组小鼠肝重。肝重系数计算如下。

肝重系数 = 肝湿重(g)/体重(g)×100%。

1.8 小鼠断头缺氧实验

小鼠60只，按雌雄比例分组、给药及体质量测定按计划进行。末次给药1 h后，于小鼠耳后2 mm逐只断颈，记录小鼠断头后呼吸时间(张口呼吸停止、舌头外露为止停止计时)。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 薏苡叶和淫羊藿及其配伍对小鼠力竭游泳时间及爬杆时间的影响

与空白对照组相比，薏苡叶组和淫羊藿组游泳时间与爬杆时间差异显著(P<0.05);与薏苡叶组和淫羊藿组相比，低剂量效果较好(P<0.05);与低剂量组相比，中、高剂量组有统计学差异(P<0.05，表1)。

Tab. 1 Effects of coix leaves and epimedium and their compatibility on exhaustive swimming time pole climbing time in mice n =10)

2.2 薏苡叶和淫羊藿及其配伍对常压耐缺氧时间与断头张口呼吸时间的影响

与空白对照组相比，薏苡叶组与淫羊藿组在常压缺氧与断头呼吸时间均得到明显延长(P<0.05)，淫羊藿组肝重具有统计学差异(P<0.05)；与薏苡叶组相比，低剂量组实验效果均有差异(P<0.05)，与淫羊藿组相比，低剂量组常压缺氧时间效果较好(P<0.05)：与低剂量组相比，中剂量组能够显著延长常压缺氧与断头维持呼吸时间(P<0.05)、肝重系数明显升高(P<0.01，表2)。

Tab. 2 Effects of coix leaves and epimedium and their compatibility on normal hypoxia tolerance time and respiratory time of broken head in mice n=10)

3 讨论

疲劳是机体面临疾病状态的前驱表现，即机体失去其完成原来所具有的正常工作与活动能力，身体各项功能开始出现暂时性降低的过程。运动性疲劳则会使机体的中枢神经系统疲劳、免疫功能下降，机体抗过氧化能力降低、抑制神经内分泌功能及造血系统功能等[12]。由一系列生化改变致肌肉收缩力降低而出现的最直接且客观的机体运动耐力的大幅度降低即为运动性疲劳。

诸多研究证实，自由基的清除是抗氧化剂发挥抗氧化作用的主要机制。薏苡叶作为常用食材薏苡的干燥叶，有较好的抗氧化活性。谭冰等[13]经研究表明薏苡叶中可能含有黄酮类、酚类等化成分，薏苡多糖具有较强的抗氧化作用。经华蔚等[14]学者通过氯仿提取薏苡叶中的有效成分并开展体外抗氧化作用的研究表明随着薏苡叶氯仿提取物浓度的升高，O2-的清除效果增强[15]。鉴此，薏苡叶的抗疲劳耐缺氧作用的有效成分可能在机体对氧气的在体内的应用与代谢过程起到催化作用，进而增强了机体耐受程度与缺氧状态下的氧气消耗水平。本研究结合沙爱龙与董寿堂两位学者的抗疲劳耐缺氧药理作用的研究发现，通过小鼠负重游泳实验反应药物的抗疲劳效果简单明了[16]。但实验效果由于个体差异难以排除特异性，若通过游泳实验先行筛选游泳时间相近的小鼠，剔除差异较大的个体，能够提高实验数据的普遍规律从而排除 实验动物的个体差异对结果的干扰[17，18]。

淫羊藿总黄酮中的淫羊藿苷作为淫羊藿耐缺氧的有效成分，通过健全脑、肺水肿，抑制缺氧炎症联级反应、减轻组织损伤，增强耐缺氧能力。其具有一定抗氧化性，且对自由基的清除也有一定作用[19]。路玲莉等[20]学者经研究表明，淫羊藿苷可有效抑制缺氧/缺糖损伤诱导ROS的产生。本研究将薏苡叶与淫羊藿进行配伍，旨在探讨二者在耐缺氧抗疲劳方面是否具有复合作用。薏苡叶和淫羊藿二者具有明显的抗疲劳耐缺氧作用[21]，通过两种单味药与三个剂量组进行效果对比分析，配伍组表现出明显的抗疲劳耐缺氧效果。二者在抗疲劳方面表现出明确的复合作用，而在耐缺氧作用方面仅在肝重系数和断头后呼吸方面表现出复合作用，对与常压耐缺氧时间并未体现出复合作用。

机体在运动过程中不断分解肝糖原进行能量供应，因此肝糖原的水平可体现机体抗疲劳的能量储备[22]。耐缺氧能力是间接反应抗疲劳能力的重要指标，小鼠常压耐缺氧实验和断头后张口喘气实验是目前研究药物耐缺氧活性的常用指标。基于此，结合肝中系数的变化与统计学差异，考虑薏苡叶和淫羊藿配伍提高了糖原在肝脏中的储备量，通过提高能量物质储备与能量供给间接提升小鼠的力竭时间与存活时间，宏观表现为抗缺氧耐疲劳药理作用的体现。二者配伍的效果优于单味药的原因可能存在三种：首先考虑薏苡叶与淫羊藿两味中药之间可能存在相互促进作用，其次考虑二者的融合导致二者中的有效成分之间进行了化学反应生成新物质具有强效的抗缺氧耐疲劳作用；第三考虑二者的配伍是否存在某有效物质的还原剂，促使其抗氧化效果的提升，基于此可合理推断，提取液浓度的升高并没有提高抗缺氧耐疲劳能力。

上述结果表明，中剂量组的抗疲劳耐缺氧效果优于其他各组，且薏苡叶和淫羊藿的水提液对小鼠有较好的抗疲劳性和耐缺氧性，实验组小鼠的肝重系数明显大于空白对照组，其抗疲劳机制可能与肝糖原的生成与储备有关，其耐缺氧机制可能与抑制缺氧损伤诱导ROS的生成有关。