酮康唑对小鼠肝脏和睾丸生理功能的影响*

贺英昊， 方 情， 杨玲玲， 陈思敏， 骆燕萍， 钱 虹， 齐敏友

(浙江工业大学药学院药理研究所， 杭州 310014)

酮康唑(Ketoconazole，KCZ)是一种咪唑类广谱抗真菌药，临床主要用于皮肤、胃肠道真菌感染，以及妇科疾病如阴道白色念珠菌病等深、浅部真菌病的治疗，但其同时会对机体带来严重的不良反应[1-3]。目前研究显示，酮康唑可导致患者出现胃肠道反应、肝功能损伤及性激素分泌紊乱等症状[4，5]。Banankhah等研究发现，酮康唑可使健康志愿者发生肝损伤，进而导致肝血清生化指标异常[6]。Franziska 认为，酮康唑可以导致巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)的分泌增加，而可以控制细胞增殖、分化的MIF，被认为是肝损伤的一个重要的早期标志物[7]。对于酮康唑引起的肝损伤机制，Iwasaki 认为，可能与其抑制肝代谢酶的活性有关[8]。除肝毒性外，酮康唑同样存在不容忽视的生殖毒性，例如男性生殖功能障碍。先前研究表明，酮康唑会引起雌二醇/睾酮比值增大，最终导致男性乳房发育和精液稀少[9]。此外，Ankley等研究发现，酮康唑可以抑制与生殖发育相关的细胞色素P450家族 19(cytochrome P450 family 19，CYP 19)酶的表达，进而抑制黑头软口鲦鱼(pimephales promelas)睾酮的生物合成，反映了酮康唑存在一定的生殖系统毒性[10]。

随着酮康唑的应用逐渐增多，其肝毒性的发生变得十分常见，总发病率可达 3.6% 至4.2%，并且不按说明书服用药物更会增加肝损伤的发病风险[11]。此外，酮康唑同样会影响男性生殖系统的功能，例如其导致的血浆睾酮水平降低[12]。本实验观察不同剂量酮康唑对小鼠肝脏、睾丸生理功能的影响，为相关动物模型的建立和临床安全用药提供实验材料。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器

酮康唑(HPLC≥98%，湖南上禾生物科技有限公司)；谷丙转氨酶试剂盒、谷草转氨酶试剂盒、乳酸脱氢酶试剂盒、γ-谷氨酰转肽酶试剂盒、酸性磷酸酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)；4% 多聚甲醛(武汉赛维尔生物科技有限公司)。紫外分光光度计(巩义市英峪予华仪器厂)；高速冷冻离心机(德国 Hermle 公司)；Nikon TS100 光学倒置相差显微镜(尼康上海有限公司)；HM 325 型 MICROM 轮转式石蜡切片机(德国美康公司)；-80℃ 超低温冰箱(美国Thermo公司)；超纯水仪(英国 ELIGA 公司)。

1.2 实验动物与分组

健康雄性昆明小鼠 40 只，SPF 级，18～22 g，由浙江医学科学院实验动物中心提供。合格证号：SCXK(浙)-2008-0033。小鼠适应性喂养一周后，随机将 40 只小鼠分为 4 组，每组 10 只：正常组、酮康唑低剂量组(30 mg/kg)、酮康唑中剂量组(50 mg/kg)、酮康唑高剂量组(70 mg/kg)。药物组小鼠按0.1 ml/10 g给药体积每日单次皮下注射相应剂量酮康唑，酮康唑低、中、高剂量组药物浓度各为3 mg/ml、5 mg/ml、7 mg/ml，正常组给予等量生理盐水，连续 3 周。

1.3 样本收集

末次给药 24 h 后，摘取小鼠眼球取血并收集血液，常温静置后 4℃ 离心取上清液，保存于 -20℃ 冰箱备用。肝脏与睾丸组织的获取：小鼠处死后，迅速开腹，小心摘取肝脏与睾丸，并于 0.9% 生理盐水漂洗后，去除表面水分，部分组织置于 4% 多聚甲醛溶液固定，剩余组织快速置于 -80℃ 冰箱保存待用。

1.4 生化指标检测

依据试剂盒说明书测定血清 ALT 与 AST 活性；冰上匀浆睾丸组织并离心，提取上清液后根据试剂盒说明书测定 LDH、γ-GT 与 ACP 的活性。

1.5 病理学检测

将肝脏与睾丸组织置于 4% 多聚甲醛溶液固定 72 h 后，石蜡包埋肝脏与睾丸组织，并切成 4 μm 厚的切片，65℃ 烘烤 40～60 min，二甲苯浸泡 15 min，梯度水洗后，用苏木精和伊红染液染色并梯度脱水、二甲苯透明后封片，最后在光学倒置相差显微镜下观察并拍照。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 酮康唑对小鼠血清 ALT、AST 活性的影响

与正常组小鼠比较，各药物组小鼠 ALT、AST 活性均显著升高(P<0.01)，且其活性的升高均随给药剂量的增加而增加，以酮康唑高剂量组活性增高最为显著；与酮康唑低剂量组相比，中剂量组小鼠ALT、AST 活性显著升高(P<0.01)；与酮康唑中剂量组相比，高剂量组小鼠ALT、AST 活性显著升高(P<0.01，表 1)。上述结果提示，酮康唑可诱导小鼠肝损伤。

Tab. 1 Changes in serum levels of ALT and AST of mice in each group n=10)

2.2 酮康唑对小鼠睾丸组织 γ-GT、ACP、LDH 活性的影响

与正常组小鼠相比，各药物组小鼠 γ-GT、ACP、LDH 的活性显著下降(P<0.01)，且以高剂量组活性下降最为明显(P<0.01，表 2)；酮康唑 3 个剂量组之间γ-GT、ACP、LDH活性差异均无显著性(P>0.05)。上述结果表明，酮康唑可诱导小鼠睾丸组织损伤。

Tab. 2 Changes of γ-GT, ACP and LDH in testis tissue of mice in each group(U/g pro, n=10)

2.3 酮康唑对小鼠肝脏组织形态学的影响

由图 1 可见，正常组小鼠肝细胞形态结构完整，细胞核大而圆，肝索整齐、紧密排列，肝血窦规则，为正常形态结构。

药物组小鼠可见肝组织坏死形态结构，坏死区肝细胞排列混乱且有水样变性，胞质色淡，细胞膜消失现象明显，肝索与肝血窦形态结构模糊。其中，低剂量组部分肝细胞水肿，细胞排列较不规则；中剂量组肝细胞部分坏死，细胞核染色加深，肝血窦较不规则，表现为急性普通型肝炎形态结构；而高剂量组肝细胞损伤最大，细胞间隙增大，肝索排列混乱，肝血窦不规则，整体肝组织表征为急性重症肝炎形态结构。上述结果表明，酮康唑可诱导小鼠肝毒性。

Fig. 1 Liver histopathology of each group(HE ×400)A： Control group； B： Low-dose group； C： Medium-dose group； D： High-dose group

2.4 酮康唑对小鼠睾丸组织形态学的影响

如图 2 所示，正常组小鼠睾丸曲细精管管腔大小基本一致，管腔内各级生精细胞排列整齐，且内容有精子。组织间质正常，无充血、出血等现象，为正常形态结构。

与正常组相比，低剂量组小鼠睾丸细胞形态结构变化较小，曲细精管管腔内径略微增大，管腔内各级生精细胞缺失较少；中剂量组管腔变大，各级生精细胞缺失较多，管腔内精子数量减少；而高剂量组管腔显著增大，各级生精细胞数量明显减少，精子数量极少或无，损伤最为严重。上述结果显示，酮康唑可诱导雄性小鼠生殖毒性。

Fig. 2 Testis histopathology of mice in each group(HE ×200)A： Control group； B： Low-dose group； C： Medium-dose group； D： High-dose group

3 讨论

本实验通过每日皮下注射酮康唑的方法诱导制备小鼠肝脏与睾丸组织损伤的动物模型。一定剂量的酮康唑可使小鼠肝脏、睾丸组织受损[13]，生理功能失调，使与其相关的特异性酶活性升高[14，15]。

作为咪唑类广谱抗真菌药，酮康唑的抗真菌活性强，其通过干扰真菌细胞膜的麦角甾醇的合成进而增大膜通透性，最终使其失去正常的生理功能[16]。在临床上，酮康唑主要应用于如甲癣、体癣、鹅口疮、脂溢性皮炎，以及阴道炎等各种深、浅部真菌感染的治疗[17]。虽然酮康唑临床疗效确切，但是其所带来的不良反应也备受人们的关注。

肝脏是机体内参与各种物质代谢的重要器官，其药物性、缺血性等损伤往往会对机体带来严重影响[18，19]。药物性肝损伤(drug-induced liver injury，DILI)，指由药物本身或其代谢产物引起的肝损害，亦或由于在用药过程中机体对药物的敏感性或耐受性降低所致[20]。酮康唑主要在肝脏中代谢，其引发的肝功能异常与服药时间及剂量有明显的正比关系。ALT 主要存在于细胞质，而 AST 主要存在于细胞质与线粒体中，当肝细胞受损时，AST、ALT 便会释放入血，因此临床上常采用检测 AST、ALT 活性的方法，以表征肝脏功能是否正常[21]。本次实验结果显示，药物组小鼠血清 AST、ALT 活性显著升高。HE 染色表明：药物组小鼠肝细胞水肿损伤，肝索排列混乱，肝血窦不规则。上述结果提示，酮康唑具有诱导小鼠肝脏损伤的作用。

众多研究发现，应用酮康唑能够明显抑制肾上腺皮质激素的合成及雄性激素的产生，甚至导致生育能力的下降、丧失[22]。Iamsaard 等研究发现，雄性大鼠在酮康唑的影响下，表征出明显的生殖毒性，其生殖器官系数、睾丸激素水平和精子浓度均有明显下降[23]。LDH是糖酵解过程中的关键酶，其与生精上皮的成熟密切相关；ACP 是在生殖毒性研究中被用来评价是否存在生精障碍的标志酶，并参与睾丸内蛋白质合成；而 γ-GT 是睾丸支持细胞的特异性标志酶，主要与促进精子的成熟有关。本实验结果显示，药物组小鼠睾丸组织 γ-GT、ACP、LDH 的活性显著下降。HE 染色可见睾丸曲细精管管腔内径增大，管内各级生精细胞排列杂乱，数量减少。上述结果提示，酮康唑可诱导小鼠睾丸损伤。因此，酮康唑能导致小鼠肝脏、睾丸生理功能紊乱，并且随着剂量的增大，小鼠肝脏、睾丸组织的生化指标、病理恶化程度愈为严重。

在本研究中，当酮康唑给药剂量超过30 mg/kg时，小鼠血清AST、ALT以及睾丸组织γ-GT、ACP、LDH活性就已发生显著性地异常改变，提示肝脏和睾丸受到了明显的损伤。因此，为了避免肝脏及睾丸毒性的发生，需要谨慎的选择酮康唑的临床给药剂量来确保用药安全。到目前，有关酮康唑具有明显肝毒性的报道十分常见，然而对睾丸的毒性报道还较少。综上所述，本研究观察了酮康唑对小鼠肝脏及睾丸生理功能的影响，为相关动物模型的建立，以及临床用药剂量的选择提供重要的实验资料。