辛伐他汀对大鼠肺纤维化及其内皮间质变过程的影响*

涂容芳， 何振华， 谭小武， 陈 哲， 曾赛丽， 刘 莎， 贾远航， 李雪花

(南华大学衡阳医学院，附属第二医院，呼吸与危重症医学科, 湖南 衡阳 421001)

肺纤维化(pulmonary fibrosis)是一种以咳嗽、进行性加重的呼吸困难为主要表现的致命性肺病，其发病原因主要与上皮/内皮细胞损伤后出现异常修复有关[1]，而异常修复的关键标志是“成纤维细胞灶形成”[2]。目前关于成纤维细胞灶形成来源有：成纤维细胞转化(fibroblast，FB)、上皮间质变(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、内皮间质变(endothelial-mesenchymal transition，EnMT)、血液循环纤维细胞四种学说，其中EnMT过程占成纤维细胞灶来源的30%以上，是近年研究的热点[3，4]。肺纤维化预后不佳、死亡率高，严重危害人类健康，依据2019年间质性肺炎指南目前除了肺移植，无特效药物。随着研究进展，近年来吡啡尼酮、尼达尼布化药物相继问世，但其临床效果不确切、价格昂贵且副作用大，临床难以实施。他汀类药物临床作用广泛且价格便宜、副作用小，深入探究其抗纤维化机制，可为新型抗纤维化药物的研发提供新的理论依据。本实验用博来霉素(bleomycin, BLM)气管内给药复制肺纤维化模型，通过观察辛伐他汀对大鼠肺纤维化及其EnMT过程中VE-cad(VE-cadherin)、VIM(vimentin)、α-SMA(alpha-smooth muscle actin)的表达变化，从而探讨辛伐他汀对肺纤维化EnMT过程的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂

注射用盐酸博莱霉素：日本化药株式会社生产(每支15 mg)；辛伐他汀片：杭州默沙东制药有限公司(20 mg*7 片/盒)。鼠抗人VE-cad 单克隆、VIM及α-SMA多克隆抗体分别购自美国R&D、ABZOOM和Epitomics公司。

1.2 动物分组及纤维化模型建立

体重为200～250 g的健康大鼠(雄性SD)共60只，随机分为：对照组(A 组)、造模组(B 组)、辛伐他汀5 mg治疗组(C 组)和辛伐他汀10 mg治疗组(D 组)，各组15只。各大鼠称重后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(2.5 ml/kg)，仰卧固定于鼠台上，颈部酒精消毒后逐层分离并暴露气管，注射器经气管软骨环间隙朝向心端刺入气管，予B、C、D组注入博莱霉素生理盐水溶液(5 mg/kg ) 复制肺纤维化模型，A组注入相应生理盐水溶液，缝合皮肤待动物自然清醒后放置笼内常规饲养。C、D 组于造模第1日起每天分别胃内灌注辛伐他汀混悬液5 mg /(kg·d)及辛伐他汀混悬液10 mg /(kg·d)；A组和B 组每天胃内灌注等体积的生理盐水10 ml /(kg·d)。

1.3 标本处理

造模后第7、14、28日以颈动脉放血法随机处死每组大鼠5只。分离气管和双肺，取左侧完整肺叶置于经焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水处理的4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，用于Masson染色和免疫组织化学检测。取右肺下叶切成小块保存于DEPC水处理过的EP管中，予以液氮瞬间冷冻后转移到-196℃液氮保存，用于进行HYP、RT-PCR测定。

1.4 Masson染色

石蜡切片脱蜡等常规处理后使用Masson 丽春红酸性复红液中染色5～10 min，经1%磷钼酸水溶液分化3～5 min，以1%亮绿酸性液染胶原纤维至绿色3～5 min，最后用95%酒精和无水乙醇脱色，二甲苯透明，中性树胶封片固定后置于电子显微镜下观察。

1.5 测定各组肺组织HYP含量

1.6 测定各组大鼠肺组织血管新生及内皮间质变相关蛋白的表达

按常规流程制作肺组织石蜡标本并包埋，切片机下切成4 μm左右薄片，按照免疫组化方法(链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法，SP 法)及试剂盒要求，依次滴加相应抗体，然后对切片依次行显色-脱水-透明-封固-镜检等操作，阴性对照中采用PBS替代一抗行相同操作。采用Weidner 微血管计数法，计算切片的微血管密度(MVD)来测定血管新生情况；测定各组VE-Cad、VIM、α-SMA蛋白表达。

1.7 测定肺组织中内皮间质变相关mRNA的表达

依照试剂盒要求提取总RNA并合成cDNA，按相应条件加入各指标引物并扩增：其中VE-cad序列F1：GCGACTACCAGGACGCTTTCA 及R1：CATGTATCGGAGG TCGATGGTG，退火温度56℃，扩增产物长度为149 bp；VIM序列F1：AGGCAAAGCAGGAGTCAAAC及R1：TCTTCCATTTCACGCATCTG，退火温度55℃，增产物长度为115 bp；α-SMA 序列 F1：TTCCTTCGTGACTACTGCTGAG及R1：CAATGAAAGATGGCTGGAAGAG，退火温度54℃，扩增长度为209 bp；β-actin序列F1: TCAGGTCATCACTATCGGCAAT 及R1: AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA，退火温度55℃，扩增长度为432 bp。取扩增产物5 μl 经1.5%的琼脂凝胶电泳，测设扩增条带的吸光光度值。每个样本重复反应3次，取平均 CT 值(阈值循环数)作为每个样本的CT 值。采用相对定量 2-△△CT法进行mRNA相对表达量比较，以folds=2-△△CT表示为BLM造模组较正常组基因的相对表达倍数，△CT=CT (目的)-CT (内参) ；△△CT=△CT (治疗组)-△CT (对照组)。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 辛伐他汀对大鼠肺组织形态的影响

A组大鼠肺组织结构正常，肺泡间隔和细支气管壁周围有少量胶原纤维沉着，余支气管壁周围未见明显胶原纤维。B、C、D组大鼠肺组织在7 d、14 d、28 d均存在不同程度肺泡组织结构破坏，部分肺泡腔融合转变为囊状或网状结构，且在各级支气管、血管及肺间质周围可见蓝绿色胶原纤维沉积，提示肺纤维化发生。与B组相应时间点比较，C、D组大鼠肺组织在结构破坏或转变、胶原沉积方面均有不同程度的改善或减轻，且D组改善比C组明显，提示辛伐他汀可减轻肺纤维化程度，且辛伐他汀10 mg组比5 mg组减轻明显(图1)。

Fig. 1 Masson staining in lung tissues of rats at the 28th day (×400)

2.2 辛伐他汀对大鼠肺组织Hyp及MVD的影响

与 A 组相比，B、C、D组大鼠肺组织的Hyp含量、MVD值在 7 d、14 d、28 d均有上升，其中B组28 d最明显，差异有统计学意义(P<0.05)，提示博来霉素可增加大鼠肺组织的Hyp含量及血管新生。相应条件加入辛伐他汀干预后C 组、D 组Hyp含量和MVD值在各时间点对比B组呈下降趋势，其中D组下降程度大于C组，以D组28 d最明显，差异均有统计学意义(P均<0.05)，提示辛伐他汀可降低大鼠肺组织Hyp含量、减轻血管新生程度，且辛伐他汀10 mg组比5 mg组降低明显(表1)。

Tab. 1 The Hyp contents and MVD n=5)

2.3 辛伐他汀对大鼠肺组织VE-cad蛋白及mRNA的影响

与A 组比较，B、C、D组VE-cad蛋白和mRNA含量在各时间点呈下降趋势，其中 B组28 d时最明显，差异有统计学意义(P<0.05)，提示博来霉素可降低大鼠肺组织VE-cad蛋白和mRNA含量；相应条件加入辛伐他汀干预后， C、D组VE-cad蛋白和mRNA含量在各时间点对比B组呈上升趋势(P< 0.05)，其中D组增加程度大于C组，以D组28 d增加最明显，差异均有统计学意义(P均<0.05)，提示辛伐他汀可增强VE-cad蛋白和mRNA表达，且辛伐他汀10 mg组比5 mg组增强明显(图2，图3，表2)。

Fig. 2 Immunohistochemistry of VE-cad in lung tissues at the 28th day (×400)

Fig. 3 The mRNA expressions of VE-cad, VIM and α-SMA in lung tissues of ratsM： DNA MAKE； A： Control group； B： Bleomycin group； C： 5 mg SIM group； D： 10 mg SIM group

2.4 辛伐他汀对大鼠肺组织VIM、α-SMA蛋白及mRNA表达的影响

与A组比较，B 、C、D组VIM、α-SMA蛋白和mRNA含量在各时间点呈上升趋势，其中B组28 d升高最明显，差异均有统计学意义(P均<0.05)，提示博来霉素可增强大鼠肺组织VIM、α-SMA蛋白及mRNA表达；相应条件加入辛伐他汀干预后，C、D组VIM、α-SMA蛋白和mRNA含量在各时间点对比B组呈下降趋势，其中D组下降程度大于C组，以D组下降28 d最明显，差异均有统计学意义(P均< 0.05)，提示辛伐他汀可减少大鼠肺组织VIM、α-SMA蛋白及mRNA表达，且辛伐他汀10 mg组比5 mg组减轻明显(图3，图4，图5，表3，表4)。

Fig. 4 Immunohistochemistry of VIM in lung tissues at the 28th day (×400)

Fig. 5 Immunohistochemistry of α-SMA in lung tissues at the 28th day (×400)A： Control group； B： Bleomycin group； C： 5 mg SIM group； D： 10 mg SIM group

Tab. 2 The protein and mRNA expressions of VE-cad in lung tissues of n=5)

Tab. 3 The protein and mRNA expressions of VIM in lung tissues of n=5)

Tab. 4 The protein and mRNA expressions of α-SMA in lung tissues of n=5)

3 讨论

传统认为，辛伐他汀属于降脂药物，但近年来越来越多研究发现其还有抗纤维化作用，具体机制尚未完全阐明。有体外试验发现，其可改变血管通透性及血管粘附，诱导人肺成纤维细胞凋亡[5]；Weis等在动物实验则显示其可减少肉芽组织生成、诱导成纤维细胞凋亡，主要机制与影响内皮细胞增殖以及血管新生有关[6]。本研究通过博来霉素一次性气管内注射复制大鼠肺纤维化模型[7]，Masson染色观察大鼠肺组织形态变化，结果发现：与A组相比，B、C、D组大鼠肺肺泡组织均出现结构破坏并融合形成囊状或网状结构，且在肺间质周围可见蓝绿色胶原纤维沉积；通过碱性水解法检测各组大鼠肺组织中HYP含量及MVD值发现与A组相比，B、C、D组大鼠肺组织的Hyp含量、MVD值在各时间点均有升高，以B组28 d最明显，提示博来霉素致肺纤维化模型造模成功且出现血管新生。辛伐他汀干预后，C、D组大鼠肺组织在结构破坏或转变、胶原沉积方面均有不同程度减轻，且D组改善比C组明显；进一步检测HYP含量及MVD值发现C 组、D 组Hyp含量和MVD值在各时间点较B组均有下降，D组下降程度大于C组，以D组28 d下降最明显，提示辛伐他汀可降低肺纤维程度，且辛伐他汀10 mg组效果优于5 mg组，其过程可能与抑制血管新生有关。而内皮细胞是血管新生的关键细胞，于是我们推测其可能主要通过影响EnMT过程减少肺纤维化形成。

EnMT是指内皮细胞在细胞因子如TGF-β1等介导下失去其特定的内皮细胞标记物如CD31、Tie-2和VE-Cad，获得间充质或肌纤维母细胞表型如α-SMA，VIM和I型胶原能力的生物过程[8，9]。EnMT最先发现于胚胎心脏形成过程，随后大量研究发现其可发生在出生后许多病理过程如癌症、心包纤维化、肾脏纤维化及类癌纤维相关疾病中[10，11]。近来研究表明内皮间质变与肺纤维化疾病密切相关，是成纤维化细胞灶的重要来源之一。蒋荣[12]等发现二氧化硅可诱导成纤维化细胞通过内皮细胞发生间质转化促进细胞外基质沉积及矽肺纤维化形成。Hashimoto[13]等在研究血管内皮细胞是否可以作为肺纤维化发展来源时，在双转基因小鼠(即内皮细胞标记物LacZ可在血管内皮细胞和内皮细胞来源的任何细胞稳定表达)进行气管内注射博莱霉素建造肺纤维化模型后，用形态学评价法观察成纤维化斑中内皮细胞来源的纤维细胞数目(即LacZ阳性)，结果LacZ 检测显示成纤维细胞灶中约16%是内皮细胞来源，且这种细胞可表达I型胶原蛋白、VIM和α-SMA。进一步研究发现EndMT不仅可通过诱导内皮细胞转变为成纤维细胞，还会造成血管新生，使毛细血管床密度减少，加重组织缺氧、缺血，促进肺纤维化形成。Jiang Y[14]和Sabbineni H[15]等在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和人原发性肺动脉内皮细胞(HPAECs) 中发现TGF-β1刺激后可通过增强间充质标记物N-cadherin和α-SMA表达，减少内皮细胞标记物VE-Cad和eNOS的表达、诱导细胞模型中内皮细胞迁移并转变为具有分泌胶原蛋白及细胞外基质特征的成纤维细胞，从而促进纤维化发生。VE-cad属于钙依赖粘附素家族成员之一，主要表达于内皮细胞，大量研究表明其可通过介导细胞粘附、维持血管通透性，在血管发生、形成及血管内环境的稳定中起着重要作用[16]。VIM主要存在于中胚层起源的内皮细胞、成纤维细胞和白细胞，可通过微管、微丝参与支撑细胞支架网络系统从而达到维持细胞完整性作用。α-SMA[17]主要存在于肌成纤维细胞，在一定程度上能反映肺组织中的胶原沉积以及肌成纤维细胞的合成情况。本实验通过SP及PCR法测定BLM致大鼠肺纤维化模型中VE-cad、VIM和α-SMA的表达水平，结果发现：与对照组相比，BLM组从7 d开始内皮细胞标志物VE-cad的蛋白和mRNA水平均出现持续降低；而间质标志物VIM、α-SMA的蛋白和mRNA水平不断增强，具有内皮细胞标志物特征的细胞逐渐转变为具有间质标志物特征细胞，提示模型组大鼠肺组织造模成功并出现了EnMT改变，由此进一步证实EnMT为肺纤维化发生重要过程，阻断该过程有可能会减轻肺纤维。辛伐他汀干预后VE-cad蛋白和mRNA含量在各时间点对比B组呈上升趋势，VIM、α-SMA蛋白和mRNA含量在各时间点对比B组呈下降趋势，且D组增加或降低程度大于C组，以D组28 d增加或减少最明显；提示辛伐他汀可有效增加VE-cad蛋白和mRNA含量、降低大鼠肺组织VIM、α-SMA蛋白及mRNA含量，且辛伐他汀10 mg组疗效优于5 mg组，由此，我们推测辛伐他汀抗纤维化机制可能与增强VE-cad表达，降低VIM及α-SMA表达，减少EnMT 发生有关。

综上所述，辛伐他汀有望作为一种新型抗肺纤维化药物，其可能通过影响EnMT过程、抑制内皮细胞向间充质细胞转变而减轻肺纤维化，其作用途径可能与TGF-β /Smads 、Notch、Wnt /β-catenin 或mTOR等信号通路有关，具体作用机制有待进一步研究证实。