PCDH15基因变异相关耳聋患者基因型与听力表型特征分析

施韬关静李进赵翠 兰兰王大勇 王洪阳王秋菊*

1 浙江中医药大学医学技术与信息工程学院（杭州 310053）

2 中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科医学部，国家耳鼻咽喉疾病临床医学研究中心，解放军耳鼻咽喉研究所，聋病教育部重点实验室；聋病防治北京市重点实验室（北京 100853）

PCDH15变异导致Usher综合征1型（USH1）或常染色体隐性遗传性耳聋23型（DFNB23）。USH1是一种以进行性视网膜色素变性（retinitis pig‐mentosa,RP）和先天性感音神经性听力损失为特征的常染色体隐性疾病，伴有先天性前庭功能障碍，运动发育迟缓、难以保持平衡[1-4]。USH1在视力异常表型出现之前，与非综合征型耳聋（Non-syn‐dromic hearing loss,NSHL）表型相同，也被称为拟非综合征型耳聋（mimics NSHL）[5]。因此，当临床中发现PCDH15变异的患者，需监测随访以鉴别是否可能为USH1。

目前，已报道的PCDH15变异位点为144个（http://www.hgmd.cf.ac.uk/,Update 2020/04），大多为国外报道，且很少有针对PCDH15变异患者的描述，国内相关报道更少。本研究通过新一代测序技术，在4个家系中检出PCDH15复合杂合变异，并分析4个家系的基因型及表型特征。

1 研究对象

研究对象为2016年3月-2019年6月在解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科就诊的4个汉族耳聋家系（图1），共18人，6名患者均为先天性极重度感音神经性耳聋，男性2名、女性4名，分别来自河北、北京、河南、山东；其中3名儿童，3名成人。收集先证者及其父母或家属血样，共18份。所有研究对象均已签署知情同意书，未成年子女由其父母签署同意书。

图1 PCDH15变异相关耳聋患者家系及听力图。B1：+/+表示c.3441 del A/c.2528 C＞A；A2：患者9月左侧植入CI后助听听阈；B2：患者29岁双耳听阈；C2：患者11月双耳听阈；D2：患者10月龄右侧植入CI后双耳听阈。Fig.1 Pedigrees of deafness families related to variants of PCDH15.B1:+/+mean by c.3441 del A/c.2528 C＞A;A2:The patient’s left hearing threshold after left cochlear implant in 9 months ago;B2:The patient’s binaural hearing threshold in 29 years old;C2:The patient’s binaural hearing threshold in 11 months old;D2:The patient’s binaural hearing threshold after right cochlear implant in 10 months ago.

2 研究方法

2.1 临床资料收集

采用项目组自主设计的问卷调查表，记录患者病史，完成家系调查并绘制家系图。对患者进行听力学检查，包括纯音测听、声导抗、畸变产物耳声发射（distortion product otoacoustic emissions,DPOAE），对婴幼儿进行听性脑干反应（auditory brainstem re‐sponse,ABR）、40Hz听觉事件相关电位（40 Hz au‐ditory event related potential,40Hz AERP）及听觉稳态反应（auditory steady state responses,ASSR）检查。听力损失程度根据500、1k、2k、4kHz平均听阈分类，分为26-40dB HL轻度、41-55 dB HL中度、56-70 dB HL中重度、71-90 dB HL重度以及＞90 dB HL极重度听力损失。对患者进行眼科检查及影像学检查，包括眼底镜检查、颞骨CT、内听道MRI，评估患者眼部是否存在异常。对患者进行1-3年电话随访及复诊，对迟发性眼部临床表型进行长期的关注。

2.2 基因测序

采集的血样提取基因组DNA，试剂盒由天根生物科技（北京，中国）提供。将DNA片段化及末端修复之后，构建DNA文库。运用新一代测序技术，对其中2名患者进行目标区域测序（Targeted Regions Sequencing,TES），2名患者全外显子测序（Whole exome sequencing,WES）。通过生物信息分析方法，确定可疑致病基因变异，先证者及其亲属均进行变异位点的Sanger验证。

2.3 致病性分析

得到变异位点后，根据美国医学遗传学与基因组学会（The American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG）指南将变异分为致病变异、疑似致病变异、意义不明的变异以及良性变异[6-8]。对于拷贝体变异（Copy number variations,CNVs），同样参考ACMG指南[9]。

3 研究结果

3.1 听力临床表型

1707699 （图1-A1：III.1），女，8岁，2月龄ABR检测，双耳气骨导在100dB nHL均无反应；ASSR检测，双耳100dB nHL均无反应；40Hz AERP检测，双耳100 dB nHL均无反应。

1707867 （图1-B1：II.3），女，29岁，先天性聋，右耳平均听阈96.25dB HL，左耳平均听阈103.75 dB HL，声导抗正常。II.2先天性聋，右耳平均听阈105dB HL，左耳平均听阈107.5 dB HL。

1808120 （图1-C1：III.3），男，3岁，7月龄ABR检测，双耳气导在100dB nHL均无反应；ASSR检测，双耳100dB nHL均无反应；DPOAE检测，双耳各频率均未引出；声导抗显示双耳A型。

1908312 （图1-D1：II.1），女，4岁，10月龄ABR检测，双耳气导在95dB nHL均无反应；ASSR检测，双耳平均听阈均为116dB nHL；DPOAE检测，双耳各频率均未引出。患儿于10月龄右侧植入人工耳蜗（cochlear implant,CI），助听后右耳平均听阈23.75dB HL。

四名先证者颞骨CT检查正常，提示无内耳畸形。

3.2 基因检测结果

家系1707699和1908312的先证者及父母进行WES检测，家系1707867和1808120的先证者进行TES检测，共检测出7种PCDH15变异（NM_033056.3），2种无义变异，2种剪接位点变异，1种错义变异，1种移码变异，1种CNV（表1）。7种变异中，c.733C＞T为已报道的致病变异位点[2]，c.2528C＞A为已报道的意义不明的变异位点[10]，根据该家系表型及ACMG指南建议（PM2+PP1+PP3,PM表示证据强度中等，PP表示辅助证据），考虑该变异位点为疑似致病。其余均为新发现的变异。

表1 基因检测结果及分析Table 1 Summary and analysis of genotype

对先证者父母及家族成员（12人）进行Sanger验证，结果显示所有亲属均为PCDH15变异单杂合携带者。家系1707699中，III.1为EX19-21del和c.1997+1G＞A复合变异遗传模式，EX19-21长度约为27kb，III.2检测结果为EX19-21 del单杂合携带。家系1707867中，II.3为c.3441 del A和c.2528C＞A复合杂合变异，II.1和II.2与II.3的变异位点相同。家系1808120中，II.3为c.733C＞T和c.157+1G＞A，家系1908312中，II.1为c.733C＞T和c.2756del T，均携带c.733C＞T这个变异位点。所有先证者均符合常染色体隐性遗传模式。

3.3 随访结果

得到变异位点后，为明确患者病因，需对患者及携带者进行随访，告知有可能存在迟发性RP表型的可能性，强调视力方面检查的重要性（表2）。

表2 先证者表型汇总Table 2 Summary of phenotype of probands

1707699 （图1-A1：III.1）于9月龄时左侧植入CI，植入后左耳平均听阈为41.25dB HL，3岁时为31.25dB HL（图2-B）。双音节言语识别率为100%，语句识别为95%。患儿18月龄能独立行走，双眼远视、散光，5岁时眼底镜检查正常（图2-A）。III.2为EX19-21del杂合携带者，目前三岁，听力正常，言语发育可。

图2 170769眼底镜检查与助听后听阈变化。A为患者眼底镜检查结果（正常）；B为患者植入CI听阈变化。Fig.2 Ophthalmofundoscopy and threshold change after CI of 170769.A:result of ophthalmofundoscopy(normal);B:threshold change after CI.

1707867 （图1-B1：II.3），主诉无眩晕、走路不稳等前庭相关功能异常，视力在正常范围之内。II.1和II.2临床表型与其相同，II.1目前33岁，13岁时右侧植入CI，使用两年后效果不佳，后未再佩戴。II.2和II.3均双侧佩戴助听器，自述交流能力一般。III代子女听力均正常，视力在正常范围之内，年龄10月-13岁。

1808120 （图1-C1：III.3），11月龄左侧植入CI，交流能力尚可。患儿确诊为运动发育迟缓，走路和下楼梯经常性的摔倒。由于年龄限制，无法进行视网膜电图检查，家长拒绝进行眼底镜检查。

1908312 （图1-D1：II.1），10月龄右侧植入CI，交流能力尚可。18月龄独立行走，视力双眼远视及散光，存在夜晚外出困难的症状，由于年龄限制，无法进行视网膜电图检查，家长拒绝进行眼底镜检查。

4 讨论

PCDH15与钙粘蛋白23是内耳毛细胞静纤毛顶连接（tip-link）的重要组成部分，内耳毛细胞是一种机械-电传感器，完成声电转换，帮助产生听觉和平衡知觉[11,12]。毛细胞顶端存在静纤毛，静纤毛的摆动可以通过tip-link的控制打开机械门控通道[13,14]。PCDH15变异改变蛋白结构域的空间形态，机械门控通道出现异常，引起USH1F或DF‐NB23[1,2,1517]。Alagramam等在成人和胎儿视网膜及内耳内发现PCDH15的表达[1]。Ahmed等发现在人眼的感光细胞中存在PCDH15，这表明USH1患者在视力方面存在缺陷，将出现进行性RP[16]。因此，USH1临床表型包括耳聋、前庭功能障碍和RP。

表3 在不同种族中PCDH15导致的USH1Table 3 USH1 caused by PCDH15 in different races

PCDH15变异导致的USH1是一种典型的mimics NSHL，患者在早期仅表现出耳聋特征，而RP是迟发性的。通常，患者10岁左右将会出现夜盲和隧道视觉等RP早期症状，随后视野进行性向心性缩小，直至完全失明[18]。有研究发现，患者在21岁时才出现RP早期症状[3]。1908312已出现夜盲的症状，并且其与1707699均为远视及散光。有研究表明在NSHL儿童中USH1发生率为1.3-2.2%[22]。在Vonam等的研究中，新一代测序能使USH1的诊断年龄早于视力损失的发病年龄[24]，为USH1家庭带来许多即时和长期的帮助[17]。本研究通过基因检测后的随访，3名最初诊断为NSHL的儿童，在检测出PCDH15变异后，随访发现视力及前庭的异常表型。

PCDH15是导致USH1的主要致病基因，在德系犹太人中PCDH15是最常见的致病基因，c.733C＞T在该人群中存在始祖效应，占据USH1的比例为50%-60%，c.733C＞T的携带率为0.79%-2.48%[2,20]。在本研究中，2名患者均有c.733C＞T致病位点，考虑将其作为中国人群PCDH15热点变异进行下一步研究。

PCDH15变异导致的USH1，除了可以通过单核苷酸变异致病，CNV同样也是关键致病变异类型。CNV与遗传性耳聋关系密切[25]。1707699外显子19-21缺失，长度约为27kb，CNV是指大于1kb的DNA片段的缺失/重复[26]。大多数已报道的CNV集中在PCDH15前5个外显子及第20外显子附近，在本研究中检测出的EX19-21 del包含在已报道的CNV范围内（表4）。由此可见，PCDH15基因除了点变异，CNV也是的主要变异类型。

表4 PCDH15已报道的拷贝体变异Table 4 CNVs has been reported in PCDH15

PCDH15表达于毛细胞静纤毛间的tip-link，其变异影响耳蜗的机电转换，CI是通过手术，将电极片植入内耳，直接作用于螺旋神经节细胞，绕过耳蜗的机电转换，进而帮助患者感知声音[35-37]。在本次研究中，通过随访发现，3例儿童CI植入效果较好，1707699植入后双音节词言语识别率达到100%。1707867的哥哥在13周岁时才植入CI，效果不佳，佩戴两年后未再使用。通过这些发现，PCDH15变异的耳聋患者均存在先天性重-极重度听力损失，早期植入CI，可以让儿童在言语发育关键期接受更多的声音刺激，言语发育更好，后期儿童可以通过视力阅读唇语，配合听觉康复来获得更好地言语发展[2-3,38]。

PCDH15变异是导致DFNB23和USH1的重要原因，USH1在临床上表现为双耳先天性重-极重度听力损失、运动发育迟缓及进行性RP。本研究为4个极重度感音神经性聋家系明确了分子病因，发现均为PCDH15复合杂合变异，其中有7个变异位点，包括2种无义变异，2种剪接位点变异，1种错义变异，1种移码变异，1种CNV，5个为新发变异位点；考虑c.733C＞T为热点变异位点，需进一步研究；通过随访，分析PCDH15致病患者听力、视力、前庭功能的临床表型，及CI佩戴效果，发现对于PCDH15基因变异导致的先天性极重度聋的患儿，在早期植入CI言语发育尚可，为PCDH15变异导致的USH1及DFNB23的分子诊断及治疗干预提供参考意见，USH1作为mimics NSHL的一种，早期诊断及干预至关重要。