MicroRNA在阿霉素心肌毒性中的作用机制*

胡 玲，周子默，周 驰，杨晓松

(1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室;3.湖北大学生科院省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室)

阿霉素(doxorubicin，DOX)是从真菌波赛链霉菌中分离出来的蒽环类抗生素，能嵌合到DNA碱基对中，干扰DNA、RNA的合成，对处于各个细胞周期中的细胞都有效。临床上单独或者和其它化疗药物合用来治疗恶性肿瘤，如各种平滑肌肉瘤、淋巴瘤等[1]。然而DOX引起的毒副作用是其使用过程中的一个严重问题，这些副作用有时会导致比治疗的疾病本身更严重的并发症，尤其是存在剂量累积效应的心脏毒性。DOX在用药初期出现的急性毒性是非特异性的，表现为各种心律失常，大多停药后能自行缓解。长期用药则会逐渐损害心功能，这种不可逆的慢性损伤为退行性心肌结构病变，最终演变成充血性心力衰竭。研究报道[2]DOX累积剂量大于550mg/m2会导致26%的患者发生DOX相关性心肌病。而且目前临床上缺乏有效的药物来缓解DOX所致的毒副作用，这些都使DOX在临床应用上受到制约。当前关于DOX心肌毒副作用的潜在机制已有较多报道，但其精确调控环节还不明确，特别是涉及microRNA(miRNA)介导的表观遗传修饰调控。

miRNA作为一种天然的内源性非编码单链RNA(约18～22nt)，通过与信使RNA的3’UTR非编码区结合，引起靶基因的去乙酰化、失稳或翻译抑制，从而抑制这些基因的表达，在不同的生理或病理过程中发挥关键作用。miRNA在心血管疾病发生发展过程中起调控作用是多种心血管疾病(包括药物性心力衰竭)新的、强有力的治疗靶点。另一方面，miRNA具备较高的物种保守性、容易检测等特性，也被作为潜在的循环生物标志物用于几种心脏疾病的诊断[3]。近期，DOX心脏毒性中有关miRNA表达调控也逐渐引起科研工作者的广泛兴趣。DOX心脏毒性中，miRNA在介导氧化应激、线粒体损伤、Ca2+动态平衡等过程中发挥关键调控作用，而通过靶向干预或药物干预miRNA在DOX心脏毒性中的表达可明显改善DOX心脏毒性，是预防或改善药物诱导心脏毒性的一种新方法。因此，我们将就miRNA在DOX心肌毒性中的作用及潜在诊断标志物和药物对miRNA的干预两个方面展开讨论。

1 miRNA在DOX心脏毒性中的作用

DOX心脏毒性机制比较复杂，涉及多种信号通路调控。DOX介导细胞内大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)的不断累积，导致细胞内的氧化水平失衡，是DOX引起心脏毒性的关键过程，也是进一步引起DNA损伤、线粒体与能量代谢功能障碍、Ca2+紊乱等多种途径介导的凋亡、坏死、焦亡、铁死亡的重要诱因[4]。

1.1 miRNA在氧化应激途径中的作用

Zhao等[5]识别了DOX诱导心脏毒性模型中大鼠心脏组织的18个差异表达miRNA，其中miR-140-5p表达明显增加，其直接靶向Nrf2和Sirt2，通过影响HO-1、NQO1、GST、GCLM、Keap 1和FOXO3a的表达水平，加重心肌氧化应激。P66Shc是ROS代谢和细胞凋亡的调节因子。Liu等[6]报道p66Shc在给予促凋亡刺激后直接促进ROS的产生，敲除Shc1后，细胞会降低ROS并对凋亡产生抵抗。而miR-124可通过抑制p66Shc信号通路来减轻氧化应激损伤。另有研究报道[7]在DOX处理的小鼠模型中，miR-143的表达显著上升，使用miR-143拮抗剂可下调DOX处理后AKT的磷酸化，并增加AKT的激活和蛋白激酶B (PKB)，减轻DOX治疗后的氧化应激。

1.2 miRNA在细胞凋亡途径中的作用

Wan等[8]使用公共微阵列数据集识别出DOX处理的心肌细胞中差异表达的miRNA和差异表达的基因，发现miR-15b-5p在DOX处理后的H9c2细胞中异常增多，骨形态发生蛋白受体-1A(Bmpr1a)显著减少，Bmpr1a下游转录因子Gata4也下调。H9c2心肌细胞的凋亡可能经miR-15b-5p/bmpr1A信号转导调控。同样基于生物信息学数据挖掘，Pakravan等[9]发现在DOX治疗后miR-130a表达显著升高而且作用于过氧化物酶增殖物激活受体(PPARγ)，特异性的拮抗miR-130a可逆转DOX诱导的PPARγ表达降低、细胞凋亡和炎症反应。Tony等[10]则通过治疗性沉默miR-208a来保存Gata4和Bcl-2，从而减少细胞凋亡，改善心功能。

此外研究报道[11]与miR-34a互补的antimiR (Ant34a)能够降低DOX治疗后大鼠心脏miR-34a水平，改善其心功能。Ant34a是通过解除心脏中miR-34a对靶点Sirt1的抑制，降低其靶蛋白p53、SMAD2/3和NF-κB的乙酰化水平，灭活下游通路，同时激活Bcl-2来降低DOX诱导的心脏凋亡。何梦颖等[12]通过对DOX处理后的心脏组织中miR-320a的检测发现其水平显著升高，且DOX对内皮细胞中miR-320a水平的影响更明显。特异性的拮抗miR-320a增加了体外培养内皮细胞的增殖，减少凋亡的发生；并证实了血管内皮生长因子(VEGF-A)是miR-320a的靶点，miR-320a/VEGF-A信号通路调控血管稳态，缓解了DOX引起的损伤，减轻心功能恶化。

1.3 miRNA在Ca2+代谢紊乱中的作用

实验[13]观察到在DOX诱导的心肌损伤中miRNA378*反义链表达下调，上调miRNA378*可以缓解内质网应激(ERS)。此外发现网腔钙结合蛋白(calumenin)可能是miRNA378*的靶点。calumenin能够降低SERCA2活性和减少钙调节蛋白(RyR2)在细胞中的释放、摄取和储存，维持钙循环稳态。miRNA378*上调后calumenin水平随之增高，葡萄糖调节蛋白GRP78减少，Bax水平减少，Bcl-2增高。miRNA378*是通过影响calumenin的表达来调节ERS和ERS介导的细胞凋亡的。miR-30是钙/钙调质信号的重要调节因子，Roca-Alonso等[14]通过DOX急性诱导体外培养的心肌细胞损伤、DOX诱导的慢性心力衰竭进行心肌miRNA谱分析，并与心肌梗死后重构心脏的miRNA谱进行比较，miR-30家族在三种模型中均下调。miR-30调控β-肾上腺素能通路，其中miR-30优先调控β1-和β2-肾上腺素受体(β1AR和β2AR)与Giα-2结合的直接抑制，且高miR-30水平对DOX毒性有保护作用。Gata6是与DOX相关的miR-30表达降低的中介，DOX是通过Gata6导致心肌细胞中miR-30的急性和持续降低。

1.4 miRNA在线粒体途径中的作用

Wang等[15]观察到在DOX诱导的细胞模型中，MiR-23a的显著升高抑制了靶蛋白PGC-1α的表达，而抑制miR-23a可通过恢复PGC-1α和抑制p-Drp1依赖的线粒体分裂和凋亡减轻DOX诱导的线粒体功能障碍。另有研究表明[16]miR-181c存在于心脏线粒体中，其过表达通过调节线粒体基因表达影响线粒体功能并发现miR-181c靶向线粒体中的MT-COX1对心肌有明显的保护作用。文献[17]报道，DOX处理过的大鼠中miR-29b是miR-29家族唯一一个心肌表达下调的。特异性上调miR-29b抑制了DOX引起的Bcl-2水平增加，Bax表达和Caspase-3活性降低。miR-29b是直接负调控Bax的表达来抑制线粒体依赖性凋亡通路。

1.5 miRNA在自噬途径中的作用

ACE2能减轻心脏负荷、降低外周阻力，显著改善左室收缩功能。ACE2过度表达可抑制miR-30e，miR-30e模拟物处理可降低Beclin-1的表达和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值。ACE2通过保存miR-30e/beclin-1信号通路上的心肌细胞自噬而减轻DOX所致的心功能障碍[18]。另有研究[19]也发现DOX处理的小鼠心脏和H9c2细胞的自噬水平均升高，高表达miR-204通过抑制自噬发挥保护作用，而HMGB1可直接与Beclin-1和ATG5相互作用，并在炎症过程中阻断calpain介导的裂解，从而维持原自噬功能。miR-204能直接降低HMGB1的表达来预防DOX诱导的心肌细胞损伤。增加miR-204的表达可能是DOX诱导的心脏损伤患者的一种新的治疗选择。

1.6 其他新靶点

miRNA不仅在DOX引起的心脏损伤中参与上述途径的调控，还介导其他靶点。过表达促肥厚型miR-212/132家族可改善心脏功能，减少DOX诱导的心脏凋亡和萎缩，并维持心肌细胞肌原纤维结构。基于转录组分析发现脂肪储存诱导跨膜蛋白2(Fitm2)是miR-212/132一个新靶点和下游效应分子，miR-212/132可抑制Fitm2的作用。除了Fitm2，过表达miR-212/132也导致其他靶点Rbfox1、Sgk3和Foxo3下调，Rbfox1缺失加重了应激诱导的心肌细胞肥大。这些额外的靶点可能与DOX心脏毒性模型中观察到的miR-212/132抗凋亡和抗萎缩作用有关。因此，这些额外的靶点可能成为限制DOX介导的不良心脏效应的治疗切入点[20]。Sun等[21]则研究了大鼠心脏组织中核仁素的表达规律，发现在体内和体外给DOX均能显著改变核仁素的表达，核仁素过表达可减轻心肌细胞来自DOX所致的损伤。此外在体内和体外核仁素上调了miRNA-21的表达，核仁素通过调节miRNA-21的表达参与了DOX所致心脏损伤和功能障碍。

1.7 miRNA作为DOX心脏毒性生物标志物

越来越多的肿瘤临床医生认识到早期识别药物所致心衰风险对于肿瘤患者治愈及其预后显得非常重要。目前，化疗药物所致心脏毒性评价主要基于左心室射血分数降低的心脏影像和循环系统肌钙蛋白及脑利钠肽等生物标志物的检测，但是，左心室射血分数对于轻微心肌功能障碍的敏感性较差，而肌钙蛋白及脑利钠肽等的评价基本都是在心肌组织损伤后才出现异常[22]。因此，miRNA作为DOX早期心脏毒性生物标志物在体内外模型中被调查。在接受蒽环类药物治疗的儿童和青年患者中，血浆miR-29b和miR-499均升高，并且在急性心脏损伤患者中早期也高于缓慢升高或正常的肌钙蛋白水平，这表明对miR-29b和miR-499的检测可能作为蒽环类药物诱导的急性心脏损伤的指标[23]。另一项针对接受蒽环类药物化疗的儿科患者的研究显示，miR-499a-5p水平从蒽环类药物方案开始到完成的变化与左心室射血分数下降正相关。这些发现可能提示miR-499a-5p可以作为接受蒽环类药物的儿童患者左心室射血分数下降的生物标志物[24]。

2 药物干预

miRNA通过多种途径介导DOX心脏毒性作用且可能作为DOX心脏毒性生物标志物这些都表明miRNA在DOX心脏毒性中发挥重要调控作用。目前，许多研究者也发现在DOX心肌毒性模型中某些化学药物及天然化合物作用于一些miRNA，可减缓DOX的心肌毒副作用。

2.1 化学药物

异丙酚是一具有抗各种毒性损伤的多功能细胞保护麻醉剂，被证明可以改善多器官的缺血再灌注损伤，如心脏、大脑和肾脏。文献报道[25]异丙酚在体外和体内靶向miR-181a/Bcl-2降低蒽环类抗癌药诱导的心脏毒性具有心脏保护作用。右雷佐生是被FDA批准用以预防DOX引起的心脏损伤的保护药物，研究[26]报道磷酸酶及紧张素同源物(PTEN)是miR-17-5p的靶基因，miR-17-5p降低了DOX处理后的心肌细胞中PTEN的水平。右雷佐生可能通过miR-17-5p/PTEN信号通路缓解DOX触发的凋亡。这是第一个表明右雷佐生可能通过调节miRNA表达及其下游信号通路来保护心肌细胞免受DOX诱导损伤的报道。

2.2 天然化合物

天然产物薯蓣皂苷能提高大鼠和小鼠心肌活力，降低CK、LDH水平，改善组织病理学和心电图改变，以保护DOX所致的心脏毒性并且薯蓣皂苷元通过调节体内外细胞内ROS、MDA、SOD、GSH和GSH-px水平，显著抑制心肌氧化损伤。薯蓣皂苷还能够降低miR-140-5p，激活Nrf2和Sirt2信号通路，从而影响HO-1、NQO1、Gst、GCLM、Keap1和FOXO3a的表达水平。因此，该天然产物未来可作为减轻DOX心脏毒性的新候选药物开发，但是该天然产物抗DOX诱导的心肌损伤的深层机制还需要进一步研究[27]。另有中药黄芪根茎中异黄酮类化合物鸢尾素(irigenin，IR)可通过减少心肌细胞凋亡、氧化应激和炎症反应，明显减轻DOX心脏毒性。重要的是，DOX可显著降低心脏组织和细胞中miR-425的水平，诱导受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)在体内和体外的过表达，而RIPK1是miR-425的直接靶点，鸢尾素可通过激活miR-425降低RIPK1的过表达显著改善DOX诱导的心脏毒性，因此，鸢尾素可被认为是一种有前景的治疗心脏损伤的药物[28]。此外，丹参酮ⅡA可逆转DOX处理后的miR-133下调进而抑制Caspase-9和相关凋亡效应物的激活，保护心脏[29]，这些都表明药物对miRNA表达水平的影响或可成为一种新的治疗DOX心肌毒性的手段。

3 结 论

综上所述，我们从两个方面介绍了miRNA在DOX心脏毒性中的作用，涉及miRNA相关信号通路调控以及作为生物标志物的重要作用。这些miRNA所涉及信号通路调控的机制研究将为临床药物治疗DOX心脏毒性提供新的作用靶点，有益于扩大DOX在临床肿瘤治疗的应用范围。但是，由于miRNA存在多个作用靶点，这为精确的靶向治疗带来新的挑战。此外，miRNA作为心脏毒性早期诊断标志物具有独特优势，但目前有关循环系统miRNA表达水平评价与心脏毒性发展所处不同阶段的相关性还缺乏数据，有待更多的临床资料进行补充。

总之，小分子miRNA可通过多种途径介导DOX心脏毒性作用，深入阐明miRNA的调控机制，对于缓解DOX所引起的心脏损伤药物开发具有重要应用价值，为临床癌症患者DOX治疗后提供心脏毒性的防治提供新的最优解决方案。