TREM2过表达减轻大鼠颅脑创伤后的认知缺陷

杨 齐，许 峰，焦 阳，张 赛，孙中磊,*

(1.枣庄矿业集团中心医院 神经外科，山东 枣庄 277000；2.武警特色医学中心，天津市神经创伤修复重点实验室，天津 300162)

神经炎性反应被定义为对不同类型的颅脑创伤(traumatic brain injurie，TBI)所作出的先天免疫系统的激活反应。脑实质中的小胶质细胞激活是神经炎性反应的标志，被认为是神经元命运的关键因素[1]。神经炎性反应与包括TBI后认知障碍在内的各种神经系统疾病的发病机制密切相关[2]。髓细胞触发受体2(triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2)是TREM家族的I型跨膜先天免疫受体，在大脑中主要在小胶质细胞中表达，在小胶质细胞激活和存活中起着重要作用[3-4]。虽然小胶质细胞是参与中枢神经系统炎性反应的主要细胞类型之一，但是根据不同的疾病和状况，它对神经元的作用不同[5]。尽管已广泛报道TREM2调节神经炎性反应，但未见报道其在TBI中的作用。本研究旨在探讨TREM2过表达对大鼠TBI后认知功能障碍的影响及其对神经炎性反应的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：SPF级雄性SD大鼠80只，24～26月龄，体质量600～700 g(北京维通利华生物技术有限公司)SCXK(京)2016-0011，饲养环境为清洁级动物室(SPF级)。所有动物实验程序均按照武警特色医学中心的动物指南进行。

1.1.2主要试剂：Trizol试剂盒(Invitrogen公司)；ReverTra Ace RT-qPCR试剂盒(Toyobo公司)；Anti Aβ1-42(amyloid β1-42)、Anti tau、Anti TREM2、Anti iNOS、Anti Arg-1和Anti β-actin(Abcam 公司)；TREM2、IL-1β、IL-6、IL-4和IL-10 mRNA试剂盒(Sigma-Aldrich公司)；RIPA缓冲液、BCA蛋白定量试剂盒、ECL试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；编码TREM2的慢病毒载体和对照慢病毒载体(上海吉凯基因化学技术有限公司)；SYBR Green实时PCR预混试剂盒(上海联迈生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物的分组及处理：将大鼠随机分为对照组(n=8)和TBI 2、5、7、14和28 d组(n=8)，采用皮质撞击致伤法建立大鼠TBI模型，余32只大鼠随机分为4组(n=8)：对照组、TBI组、(TBI+Null)组和(TBI+TREM2)组，按文献所述，(TBI+Null)组脑室内注射对照慢病毒载体，(TBI+TREM2)组脑室内注射等量编码TREM2的慢病毒载体，在对应天数安乐死，取脑组织用于下一步研究[6-7]。

1.2.2 Morris水迷宫实验检测记忆功能：实验第24～28 d，通过Morris水迷宫试验观察大鼠学习记忆功能。

1.2.3 RT-qPCR检测mRNA：按照使用说明，使用Trizol试剂从小鼠脑组织中收获总mRNA，按照表1中引物序列，使用RT-qPCR试剂盒合成cDNA，SYBR Green实时PCR预混试剂盒进行反转录酶RT-qPCR分析，StepOnePlus实时荧光定量PCR仪实时定量分析mRNA，以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法分析。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences of PCR

1.2.4 Western blot检测蛋白：将脑组织破碎后使用RIPA缓冲液从脑组织中收集蛋白质，BCA法测定蛋白总浓度，利用SDS-PAGE，电泳后，半干转移至聚偏二氟乙烯膜上。使用5%脱脂牛奶在室温下封闭膜2 h，然后在4 ℃下分别与一抗(anti TREM2、anti iNOS、anti Arg-1、Aβ1-42、anti tau和anti β-actin)孵育过夜。用TBST洗涤后将膜与山羊抗兔二抗(1∶2 000)在室温下孵育1 h。使用增强的化学发光系统(ECL试剂盒)检测免疫反应性条带，并使用ImageJ 1.42q软件程序分析图像。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 TREM2在TBI大鼠中上调

TBI组TREM2 mRNA及蛋白质水平较对照组明显升高(P<0.05)，且TREM2 mRNA和蛋白水平的峰值均出现在TBI后3 d(图1A～C)。

A.TREM2 and β-actin Western blot bands;B.quantification of TREM2 protein expression;C.quantification of TREM2 mRNA expression;*P<0.05,**P<0.01 compared with control group图1 各组大鼠TREM2蛋白和mRNA表达水平Fig 1 Expression levels of TREM2 protein and mRNA in each n=8)

2.2 TREM2过表达减轻了TBI大鼠的认知缺陷

与对照组相比，第28天 TBI组和(TBI+Null)组大鼠的逃避潜伏期显著延长(P<0.05)；与(TBI+Null)组相比，(TBI+TREM2)的逃避潜伏期显著缩短(P<0.05)(表2)。

表2 各组大鼠逃避潜伏期Table 2 Escape latency of rats in each n=8)

2.3 TREM2过表达改变了TBI大鼠脑组织的小胶质细胞表型

与对照组相比，TBI组和(TBI+Null)大鼠脑组织小胶质细胞M1型标志物iNOS表达水平升高，小胶质细胞M2型标志物Arg-1表达水平下降(P<0.05)；与TBI组相比，(TBI+TREM2)组大鼠脑组织小胶质细胞M1型标志物iNOS表达水平下降，小胶质细胞M2型标志物Arg-1表达水平升高(P<0.05)(图2A～C)。

A.iNOS and Arg-1 protein Western blot bands;B.iNOS protein quantification;C.Arg-1protein quantification；*P<0.05 compared with sham;#P<0.05 compared with the TBI+Null图2 TREM2过表达改变TBI大鼠脑组织的小胶质细胞表型Fig 2 TREM2 over-expression altered microglial phenotypes in brain tissues of TBI n=8)

2.4 TREM2过表达减弱了TBI大鼠的炎性反应

与对照组相比，TBI组和TBI+Null组大鼠脑组织促炎性介质(IL-1β，IL-6)表达水平升高，抗炎介质(IL-4，IL-10)表达水平下降(P<0.05)；与(TBI+Null)组相比，(TBI+TREM2)组大鼠脑组织促炎性介质(IL-1β，IL-6)表达水平下降，抗炎介质(IL-4，IL-10)表达水平升高(P<0.05)(图3A,B)。

A.quantification of IL-1β and IL-6mRNA expression;B.quantification of IL-4 and IL-10 mRNA expression;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with the TBI+Null group图3 大鼠脑组织神经炎性反应相关因子mRNA表达水平Fig 3 mRNA expression levels of neuroinflammation-related factors in rat brain n=8)

2.5 TREM2过表达抑制了认知障碍相关蛋白表达

与对照组相比，TBI组和(TBI+Null)组Aβ1-42、tau 蛋白水平明显升高(P<0.05)；与(TBI+Null)组比，(TBI+TREM2)组Aβ1-42、tau 蛋白水平明显下降(P<0.05)(图4)。

A.Aβ1-42 and tau protein Western blot bands;B.Aβ1-42 protein quantification;C.tau protein quantification；*P<0.05 compared with sham;#P<0.05 compared with the TBI+Null图4 大鼠脑组织认知障碍相关蛋白表达水平Fig 4 Expression levels of cognitive impairment related proteins in rat brain n=8)

3 讨论

本研究结果表明，TBI大鼠的脑组织中TREM2基因和蛋白质水平较对照组上调，表明TREM2可能参与TBI的发病，TREM2的过表达可减少脑组织中认知障碍相关蛋白(tau和Aβ1-42)表达，减轻大鼠认知缺陷。TREM2还通过修饰小胶质细胞表型来调节炎性因子的释放，这也解释了TREM2对TBI大鼠神经炎性反应的抑制及神经功能的保护作用。

许多报道表明，神经炎性反应是包括TBI后认知障碍在内的多种神经系统疾病发病机制的主要诱因[8-9]。TBI后认知障碍的神经炎性反应的特征是活化小胶质细胞释放的炎性介质水平升高[10]。新近有报道TREM2参与了多种神经系统疾病的炎性反应机制，例如，脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)处理的APP/PS1双转基因小鼠的研究表明TLR4/TREM2可能是阿尔茨海默病(Alzheimer’s diseasem,AD)与全身炎性反应之间的潜在联系，还有研究表明TREM2通过减少神经炎性反应和多巴胺神经元的凋亡对帕金森病具有神经保护作用[11-12]。总之，TREM2可能是多种神经系统疾病中炎性反应的上游调节剂。

神经炎性反应主要由小胶质细胞驱动，小胶质细胞是中枢神经系统的先天免疫细胞，在脑代谢和生理学等方面起核心作用[13]。活化的小胶质细胞分为促炎性M1型和抗炎性M2型，它们一方面通过分泌促炎细胞因子引起神经元损伤，另一方面通过释放抗炎介质而发挥有益作用。近年来TREM2与小胶质细胞之间的关系备受关注，TREM2修饰了P301S tau转基因小鼠的小胶质细胞表型[14-15]。TREM2还可拮抗淀粉样蛋白的病理改变和相关毒性，表明TREM2在体内具有神经保护作用，可作为一种治疗AD的靶标药物来探索[16]。

总之，本研究表明TREM2的过表达通过调节活化的小胶质细胞表型和减少炎性反应来减轻认知缺陷。这些发现为TREM2在TBI后认知障碍发病机制中的作用提供了新线索。