miR-29b抑制剂降低小鼠肝脏内胆固醇合成

蔡君艳

(东南大学附属中大医院 心血管内科，江苏 南京 210000)

高胆固醇血症(hypercholesterolemia)是冠心病、脑梗死等心血管疾病的独立危险因素，严重威胁人类健康。控制高胆固醇血症能够有效降低心脑血管疾病的发生。目前临床上主要采用他汀类药物降低胆固醇，而口服他汀类药物时患者会出现乏力、肌肉酸痛、肝脏转氨酶升高甚至横纹肌溶解等不良反应。因此，探寻新型降低胆固醇的药物具有重要意义。microRNAs是一类由内源基因编码、长度约22个核苷酸的小非编码单链RNA分子。它可与信使RNA的特定序列结合，参与转录后基因表达调控，在一系列生理、病生理过程中发挥重要作用[1]。miR-29b在高血压、心肌病等疾病中发挥重要作用，但对高胆固醇血症的作用尚未见报道[2-3]。本研究以高脂喂养小鼠为研究对象，观察miR-29b对胆固醇代谢的影响，并探讨可能的机制，为发现新型降胆固醇药物提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:45只SPF级C57/BL6雄鼠(体质量20～22 g)(北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格号：NO.201807103)。

1.1.2 主要试剂:高脂饲料含15%脂肪，1.25%胆固醇，0.5%胆酸钠(北京维通利华实验动物技术有限公司)；乱序无意义阴性序列(scrambled shRNA)、miR-29b抑制剂(miR-29b antagomir)(广州锐博生物科技有限公司)；总胆固醇测定试剂盒、三酰甘油测定试剂盒、RNA trip和BCA蛋白定量试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)；鼠抗Actin抗体(Santa Cruz Biotechnology公司)；兔抗SIRT1抗体(Cell Signaling Technology公司)；兔抗SREBP2抗体(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分组及处理：将小鼠分为：正常饮食组(Con组，n=10)、高脂饮食组(HF组，n=10)、正常饮食+miR-29b抑制剂对照组(Con+shRNA组，n=6)、正常饮食+miR-29b抑制剂组(Con+antago组，n=6)、高脂饮食+miR-29b抑制剂对照组(HF+shRNA组，n=6)、高脂饮食+miR-29b抑制剂组(HF+antago组,n=6)。Con+shRNA组和HF+shRNA组按照2.5 mg/kg体质量通过尾静脉注射scrambled shRNA，Con+antago组和HF+antago组按照 2.5 mg/kg体质量通过尾静脉注射miR-29b拮抗剂。小鼠共饲养8周，每周注射1次核酸以保证转染效果。

1.2.2 标本的收集：摘眼球取血，滴入肝素钠处理过的离心管中，在4 ℃以3 000×g离心10 min分离血浆备用。

取新鲜肝脏置于冻存管中，经液氮迅速降温后，转移至-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2.3 总胆固醇和三酰甘油的测定:使用总胆固醇、三酰甘油测定试剂盒按照说明书操作。将相应试剂盒中的R1(含显色剂)与R2(含酶)按4∶1混匀，即为反应液。称取50 mg肝脏，按照1 mg肝脏加30 μL组织裂解液的比例，加入适量裂解液，冰上高速匀浆1 min。将肝脏组织裂解液在70 ℃水浴煮10 min，然后转移至离心管中，室温2 000×g离心10 min。弃组织碎片，取上清至新离心管中。向96孔板中加入190 μL反应液，再加入10 μL标准品或者肝脏裂解液，充分混匀。37 ℃反应20 min，将96孔板置于酶标仪中，在570 nm处读取A值。

1.2.4 RT-qPCR检测mRNA的表达:使用RNA提取试剂提取血浆及肝脏的总RNA。实时定量PCR采用Promega Go Taq qPCR Master Mix，20 μL体系按照如下扩增条件操作：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环；95 ℃ 1 min，55 ℃变性30 s，95 ℃ 30 s。数据分析使用MxProMx3000软件进行分析。引物见表1。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.2.5 Western blot检测SIRT1、SREBP2表达水平：使用组织裂解液提取肝脏的总蛋白。BCA试剂盒测定蛋白含量。10% SDS-PAGE胶电泳分离80～100 μg蛋白。转膜，用5%脱脂牛奶封闭，4 ℃一抗孵育NC膜过夜，洗膜后室温孵育二抗1～2 h，TBST洗膜后暗室显色、曝光。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组小鼠血浆和肝脏中miR-29b的表达

高脂饮食小鼠血浆及肝脏中miR-29b表达升高，miR-29b抑制剂可抑制高脂饮食小鼠血浆和肝脏中miR-29b的表达(表2)。

表2 各组小鼠血浆和肝脏中miR-29b的表达Table 2 Expression of miR-29b in plasma and liver

2.2 各组小鼠血浆和肝脏中总胆固醇和三酰甘油的含量

HF组小鼠与对照组相比，血浆和肝脏中总胆固醇升高；HF+antago组小鼠血浆和肝脏中总胆固醇较HF+shRNA组明显降低。而Con+antago组与Con+shRNA组小鼠相比，血浆和肝脏中的总胆固醇和三酰甘油无明显变化(表3，4)。

表3 各组小鼠血浆中总胆固醇和三酰甘油的含量Table 3 Total cholesterol and triglyceride in plasma

表4 各组小鼠肝脏中总胆固醇和三酰甘油的含量Table 4 Total cholesterol and triglyceride in liver

2.3 各组小鼠肝脏中SIRT1、SREBP2、HMGCR的mRNA表达

HF组与对照组小鼠相比，肝脏中SIRT1 mRNA表达降低，而胆固醇合成相关蛋白SREBP2、HMGCR mRNA表达增加。抑制miR-29b表达后，肝脏中SIRT1 mRNA表达增加，SREBP2、HMGCR mRNA表达减少(表5)。

表5 各组小鼠肝脏中SIRT1、SREBP2、HMGCR的mRNA表达Table 5 mRNA expression of SIRT1,SREBP2,HMGCR

2.4 各组小鼠肝脏中SIRT1和SREBP2的蛋白表达

与Con组相比，HF组小鼠肝脏中SIRT1表达减少，SREBP2表达增加。抑制miR-29b表达，肝脏中SIRT1表达增加，SREBP2表达减少(图1)。

3 讨论

高胆固醇血症是多种疾病的危险因素，而体内胆固醇主要有两个来源，一是小肠从食物中摄取胆固醇，二是体内以乙酰CoA为原料合成胆固醇[4]。肝脏是合成胆固醇的主要场所。因此，抑制肝脏内胆固醇合成是治疗高胆固醇血症的重要方法。本研究以高脂喂养的小鼠为动物模型，发现高胆固醇血症小鼠血浆中miR-29b显著升高；尾静脉注射miR-29b antagomir后可降低血浆中总胆固醇，说明miR-29b可作为调节胆固醇代谢的靶点。

miR-29b是miR-29家族成员之一，由染色体7q32.3、染色体 1q32.2编码转录，在2型糖尿病、高血压、肿瘤等多种疾病中发挥重要作用[5-6]。本实验发现高胆固醇血症的小鼠的血浆和肝脏中miR-29b表达升高；而抑制miR-29b表达后，高胆固醇血症小鼠血浆和肝脏中总胆固醇降低。这一结果提示miR-29b可参与调节胆固醇代谢。

SIRT1是调节胆固醇代谢的重要蛋白[7]。前期研究发现miR-29b通过位于SIRT1 mRNA 3′非翻译区的靶位点抑制SIRT1的表达[8-9]。在血管平滑肌中，miR-29b抑制剂可促进SIRT1的表达，而miR-29b类似物可抑制SIRT1的表达[10]。在本实验中，给予高胆固醇血症小鼠注射miR-29b拮抗剂后，肝脏中SIRT1表达显著增加。

SIRT1是NAD+依赖的去乙酰化酶，可使SREBP2去乙酰化，同时促进SREBP2降解，从而降低胆固醇合成限速酶HMGCR和HMGCS的表达[11-12]。本实验发现，给予高胆固醇血症小鼠注射miR-29b antagomir后，肝脏中SREBP2表达降低，参与胆固醇合成的限速酶HMGCR表达亦降低，从而抑制肝脏内胆固醇合成，降低血清中总胆固醇。这给后他汀时代的降脂治疗带来新方案。目前已有通过RNA干扰技术特异性的沉默肝脏内编码前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)蛋白的mRNA药物，因而抑制miRNA表达的药物未来可期。另一方面，Con+antagomir组小鼠肝脏中SREBP2和HMGCR表达虽然减少，但血浆中胆固醇表达未见明显下降，提示在正常饮食情况下，尾静脉注射miR-29b抑制剂后，虽然肝脏内胆固醇合成减少，但胆固醇的摄取可能增加，从而维持胆固醇的代谢平衡。

*P<0.01 compared with control group;#P<0.01 compared with Con+shRNA group图1 各组小鼠肝脏中SIRT1和SREBP2的蛋白表达Fig 1 Protein expression of SIRT1 and SREBP2 in liver

综上所述，在高脂喂养的小鼠模型中，miR-29b拮抗剂可使肝脏中SIRT1表达升高，促进下游SREBP2的去乙酰化，从而减少胆固醇合成限速酶HMGCR的表达，抑制肝脏内胆固醇合成，最终降低血浆中总胆固醇。