阴道微生物在宫颈疾病发生发展中的作用

秦丽，朱莉，王瑞雅，任志帅，郭玉琪

(郑州大学人民医院/河南省人民医院 妇产科，河南 郑州 450003)

宫颈疾病是指宫颈组织区域发生的各种病变，主要包括宫颈炎、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasias，CIN)和宫颈癌等。CIN被视为癌前病变，分3级。宫颈癌是全球女性第四大常见癌症，发病率和死亡率均排名第四[1]，在发展中国家形势更为严峻。宫颈癌是少有的病因较为明确的肿瘤性疾病，持续的高危型人乳头状瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染是绝大部分宫颈癌及癌前病变发生的必要非充分条件。HPV感染是全世界最常见的性传播感染，绝大多数女性在一生中都曾感染HPV，其中大多在1～2 a内自然清除，少数人会出现宫颈病变乃至发展为宫颈癌[2]。阴道微生态环境对HPV的感染及致病有重要影响，其中阴道微生物群落结构在宫颈疾病的发生发展中发挥着重要作用，许多研究表明，相对于以乳杆菌(Lactobacillus)为主导的群落，以细菌性阴道病相关细菌(bacterial vaginosis-associated bacteria，BVAB)为主导的群落结构更可能与宫颈疾病的发生发展呈正相关，本文将对这些研究进展进行综述。

1 阴道微生物群组概述

1.1 阴道微生物群组的定义和发展阴道微生物群组是指特定时间内定植于女性阴道中的所有微生物的总和，包括细菌、真菌、病毒、支原体及衣原体等，这些微生物的所有基因序列的集合称为阴道微生物组，其中包括与宿主同源的基因序列部分。随着对人体微生物的深入研究，人们已经发现人体微生物群组与宿主之间通过共进化、共发育、共代谢、互调控等方式进行的相互作用[3-6]。随着科学技术的进步，新一代分子测序技术的使用越来越普遍，研究微生物组成主要通过基于16S、18S rRNA或其他标志基因或基因组区域进行分析，对生物样品扩增、测序，最后根据序列划分为不同门类。2010年Ravel等[7]通过对396名来自4个民族的北美育龄期妇女的阴道微生物组学分析，首次将正常健康女性生殖道微生物组成分为5类主要的菌群结构类型(community state types，CST)，其中CST Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ的核心优势菌群分别为卷曲乳杆菌(L.crispatus)、格氏乳杆菌(L.gasseri)、惰性乳杆菌(L.iners)和詹氏乳杆菌(L.jensenii)，存在于73%的女性中，而CST Ⅳ则主要由非乳杆菌属细菌组成，大部分为专性厌氧菌，包括奇异菌属(Atopobium)、加德纳菌(Gardnerella)、普氏菌(Prevotella)等。随后的研究将CST Ⅳ进一步细分为Ⅳ-A和Ⅳ-B子组[4,8]。

1.2 阴道微生物与生殖健康对于人体其他部位，微生物群组多样性通常是有益的，例如肠道微生物，然而对于女性生殖道来说，较为单一的以乳杆菌为主导的菌群结构似乎被认为更为健康。研究发现，乳杆菌可通过多方面机制保护女性阴道健康，主要有：(1)通过代谢产物间接发挥作用，乳杆菌可产酸降低pH，分泌生物活性化合物等；(2)乳杆菌自身的生物学特性可直接发挥作用，包括竞争营养和组织黏附[9-12]。乳杆菌可使阴道管腔内的碳水化合物转化为乳酸，在酸性环境下，乳杆菌可以通过上皮细胞表面的糖蛋白(纤连蛋白)较牢固地黏附于阴道上皮，这会在一定程度上抑制其他病原体的定植。此外，乳杆菌还可通过产生过氧化氢和细菌素等物质抵抗其他细菌[9-13]。近年来许多研究报道了乳杆菌具有增强宿主固有免疫和适应性免疫、直接抑制病毒和细菌、增强肠道上皮细胞屏障功能等作用。Abramov等[14]使用宫颈阴道上皮模型评估了卷曲乳杆菌2029及其S层蛋白2抵抗生殖道病原体的作用及机制，证明其抑制MALP-2诱导的上皮细胞中白介素-8的产生并增加抗炎细胞因子白介素-6的产生，维持女性生殖道稳态[15]。然而并不是所有乳杆菌都有益健康，某些类型的乳杆菌是有害的，缺乏有益健康的乳杆菌或者阴道内存在有害菌株的女性遭受性传播感染的风险更高[16-17]。准确识别有利于生殖道健康的微生物群组是预防和治疗女性生殖道疾病中的一项重要任务。

1.3 阴道微生物与宿主的相互作用女性青春期和更年期阴道微生物组成容易发生巨大变化，从而一定程度上影响女性的生殖健康。某些女性阴道微生物群的组成有着高度动态变化的特征，而另一些女性则相对稳定，这可能是某些女性对部分生殖道疾病更易感的重要原因。有研究表明，CST I最趋于稳定，而CST Ⅳ容易发生变化，以卷曲乳杆菌为优势菌的阴道微生物群组更有可能先转变为惰性乳杆菌为主或混合性乳杆菌的阴道微生物群组，而不是直接向完全的菌群失调转变[4,18-19]。阴道微生物之间相互作用并受到宿主机体的调控，同时也反过来调节宿主局部免疫功能，某些微生物与宿主基因组相互作用，维持相对独立的生态环境[20]。当外来病原体入侵，阴道微生态失衡时，阴道微生物群组也发生相应的变化。

2 HPV与宫颈疾病

几乎所有宫颈疾病都与HPV有关，HPV属于空泡病毒A属，是无包膜小型双链环状 DNA病毒，主要侵犯人体皮肤和黏膜的基底上皮细胞，最易侵犯的是鳞状上皮细胞基底层以及鳞柱交界处的上皮细胞和化生细胞。HPV感染的主要途径是性传播，此外是垂直传播和密切接触传播。HPV通过性行为等产生的微小创口感染人体，进入细胞并开始转录，经过一段时间的潜伏后，病毒基因与宿主基因整合，HPV E6、E7可结合抑癌蛋白p53、pRB，诱导细胞不断增殖、分化，并产生病毒颗粒，感染其他细胞。在此期间宫颈阴道部的局部免疫功能未能及时清除HPV，普遍认为高危型HPV通过E6、E7等癌相关基因下调了先天性和适应性免疫反应，逃避了免疫监视，导致不典型增生乃至CIN，HPV以及其他协同促进因素如局部免疫功能障碍、菌群失调、性激素的使用、吸烟等的持续作用，最终导致宫颈癌的发生。在病毒和宿主的博弈中，炎症反应、氧化应激反应等均可使宿主DNA受损，从而利于病毒基因成功整合[21-23]。

3 阴道微生物群组与HPV感染

阴道炎症被视为HPV感染的影响因素。乔峤[24]通过横断面研究以及纵向观察研究发现支原体感染是阻碍高危型HPV自然清除的主要影响因素。一项系统性评价表明细菌性阴道病(bacterial vaginosis，BV)、衣原体和解脲支原体与HPV感染增加有关，假丝酵母菌与HPV感染减少有关，BV与CIN的发生有关[25]。然而，其中的因果关系存在可逆性解释，同时一些报道的研究方法及结果仍有争议。近年来，分子生物学技术的高速发展使广大学者得以从基因组学层面研究阴道菌群结构的整体差异与BV、HPV等病原体的易感性是否存在关联。一般认为，CST Ⅰ和丰度较高的卷曲乳杆菌可能对抵抗HPV感染具有一定作用。在韩国双胞胎中进行的一项使用高通量测序技术检测阴道微生物群组和HPV感染情况的纵向研究显示，梭菌，特别是纤毛菌属(Sneathia)，可作为HPV感染的微生物标志[26]。最新的一项系统评价显示，与卷曲乳杆菌相比，微生物群组以非乳杆菌属或惰性乳杆菌属为主的患者受HPV感染的风险高3～5倍，受高危型HPV感染和发生CIN/宫颈癌的风险高2～3倍[27]。一项在北美女性中进行的微生物组学研究显示，阴道菌群为CST Ⅲ或CST-Ⅳ且存在高比例奇异菌属、普氏菌、加德纳菌的女性，最有可能存在HPV持续阳性，且感染清除的速度最慢[28]。一项随访1 a的研究显示，HPV阳性妇女的宫颈微生物丰富度低于HPV阴性妇女，且绝经后组较绝经前组差异更大，德氏乳杆菌与持续性HPV感染呈负相关，而属于普氏菌属等9个类群的阴道微生物与HPV的持续感染呈正相关[29]。另一项采用焦磷酸测序法检测阴道CST的研究显示，CST Ⅳ-BV为HPV持续感染的危险因素，奇异菌属和来自加德纳菌的唾液酸酶基因可作为HPV持续感染的微生物标志[30]。总之，基于测序分析技术的研究提示阴道微生物群组切实影响HPV的感染和清除。

4 阴道CST与宫颈疾病

HPV持续感染期间，阴道微生物群组会继续影响宫颈疾病的发生发展。相当多纵向研究显示，过渡状态的菌群结构(如CST Ⅲ和CST Ⅳ-B)可能导致促炎状态，从而引起宫颈阴道组织损伤并促进E6/E7表达，使宿主基因组呈不稳定状态且易与病毒整合，之后进展为高级别鳞状上皮内病变。许多特定微生物属种与CIN有关，如卷曲乳杆菌缺乏程度的加重与CIN严重程度的升高有关，纤毛菌属的富集与癌前病变和浸润性宫颈癌有关[31]。最近的一项前瞻性纵向研究[32]分析了阴道微生物群组与CIN2自然进程之间的关系，评估阴道微生物群组结构是否可用于预测疾病结局。研究人员收集了87例确诊为CIN2病变且未治疗的16～26岁女性的阴道样本，进行细菌DNA测序，调查这些患者24个月内CIN2消退率。结果显示：阴道主导菌群为乳杆菌的患者，12个月时CIN2更可能消退，而乳杆菌的减少和特定厌氧菌群的存在则与CIN2的持续存在及消退缓慢有关，具有CST Ⅳ菌群结构的女性病情消退较具有CST Ⅰ或Ⅲ菌群结构的女性慢。这些提示以乳杆菌为主导的阴道微生物群组在宫颈疾病的发生发展过程中发挥着保护作用，而其他类型菌群则可能促进了宫颈疾病的发展。

5 BVAB与宫颈疾病

BVAB是指可引起BV症状的一系列微生物，主要包括加德纳菌、奇异菌属及普氏菌等。微生物组学分析提示，BVAB是导致HPV感染后转归恶化和宫颈疾病进展的主要微生物因素，其主要通过影响细胞代谢、免疫反应、分泌细菌毒素等机制发挥作用。采用代谢组学等生物信息分析技术研究发现，HPV阳性女性比阴性女性具有更高的生物胺和磷脂水平[33]，而生物胺的产生被认为与BVAB有关[34]。BVAB可产生较多的短链脂肪酸，具有促炎作用，也有研究指出BV能提高宿主细胞活性氧水平，增加DNA氧化损伤，促进肿瘤进展[20,35]。多项研究表明，BV和BVAB会影响阴道免疫环境，包括细胞因子/趋化因子，抗微生物蛋白和免疫细胞群[36]。一般情况下，宿主的炎症反应可抵御包括HPV在内的性传播感染，但长期处于炎症状态对宫颈细胞有害，可导致DNA损伤及潜在的癌变。以BVAB为主的CST Ⅳ更容易引发炎症反应，这可能与其破坏阴道屏障作用有关[35-36]。此外，研究发现加德纳菌属分泌毒素和惰性乳杆菌分泌毒素分别在pH升高和降低时发挥作用并相互调节[37]。Shishpal等[38]首次从阴道加德纳菌ATCC 14019中分离出膜囊泡并进行蛋白质组学分析，证实了阴道溶细胞素的存在，膜囊泡可诱导产生细胞毒性，提高上皮细胞中促炎性细胞因子白介素-8水平，促进红细胞溶解，表明膜囊泡可能参与细胞毒性蛋白和其他毒力因子向宿主细胞的传递，有助于增强与BV发病有关的细胞损伤。BV相关的细胞损伤则为HPV侵入细胞、持续感染提供了土壤。

6 乳杆菌与宫颈疾病

尽管以乳杆菌为主的益生菌的抗癌活性很早就被发现，但其中的机制并未被详细阐明。Motevaseli等[39]通过用卷曲乳杆菌和格氏乳杆菌处理正常细胞和HeLa宫颈癌细胞系，比较正常细胞与宫颈癌细胞对阴道乳杆菌常见成分的增殖和凋亡反应，结果显示阴道乳杆菌对宫颈癌细胞具有细胞毒作用，而对正常细胞没有作用，并且这种细胞毒性与pH和乳酸无关。另一项体外研究评估双歧杆菌SPM1005-A对SiHa宫颈癌细胞系的细胞毒作用，其将双歧杆菌SPM1005-A、HPV 16以及宫颈癌细胞混合后共同孵育，通过实时定量聚合酶链反应检测E6和E7癌基因表达情况，通过免疫印迹法检测蛋白质水平，结果显示双歧杆菌SPM1005-A通过抑制E6和E7癌基因表达而发挥抗病毒活性[40]，提示双歧杆菌SPM1005-A可能具有预防HPV相关宫颈癌的潜在价值。乳杆菌还可能通过分泌细胞因子的方式作用于病毒和细胞。Jacouton等[41]通过HPV诱导的小鼠同种异体移植模型验证了干酪乳杆菌BL23菌株通过TH17细胞发挥抗肿瘤作用，并构建了可产生并有效分泌具有生物活性的白介素-17A的重组乳酸乳球菌，进一步验证TH17细胞对乳杆菌抗肿瘤特性的重要性。

7 益生菌及益生元的应用

基于乳杆菌保护宫颈的积极作用，益生菌在宫颈疾病防治领域的应用日益受到重视。目前，益生菌类膳食补充剂基本均含有乳杆菌，通过口服补充发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌有助于阴道微生态环境恢复正常。一项临床病例对照研究显示，相对于益生菌短期使用者，长期使用者清除HPV和逆转宫颈细胞学异常的概率更高[42]。Kawana[43]研发了一种基于乳杆菌的治疗性HPV疫苗(表达HPV E7的干酪乳杆菌)，可诱导肠道黏膜的抗HPV细胞免疫，静脉注射HPV 16或18 E6/E7 siRNA聚合微团，分别抑制了SiHa或HeLa细胞形成的皮下肿瘤的生长。口服乳杆菌/乳铁蛋白复合物使益生菌定植于阴道，可有效改善阴道感染症状[44]。Verdenelli等[45]评估了不同乳杆菌菌株对HeLa细胞的黏附作用、对念珠菌的抗菌作用，以便筛选益生菌菌种，便于临床特异性应用。大部分研究肯定了益生菌的使用对于重建女性阴道微生态环境、清除HPV和逆转宫颈疾病进程方面的积极作用，也有部分研究认为疗效尚不确切，但长期观察未发现不利作用。除益生菌外，益生元也用于增强人体中有益细菌的产生，益生元是不易消化的碳水化合物，如低聚半乳糖、低聚果糖等，具有调节微生物组成的作用，有助于詹氏乳杆菌、卷曲乳杆菌和阴道乳杆菌等的生长。

8 总结与展望

女性生殖道健康与阴道微生物环境密切相关，随着高通量测序等分子技术的广泛应用，微生物代谢组学、宏基因组学蓬勃发展，提高了微生物群组研究的效率和准确性。新近的大量研究证实了阴道微生物群组参与宫颈疾病的发生和发展，通过影响阴道微环境，参与生殖道感染，影响HPV的感染和疾病转归，甚至导致宫颈癌的发生。不同阴道CST类型的女性暴露于HPV时结局不同，以卷曲乳杆菌为主导的CST类型更能避免宫颈疾病的发生及进展。为预防或更早地发现宫颈疾病，微生物和代谢物联合检测是未来的研究方向。微生物参与肿瘤的诊断与治疗越来越成为共识，需要进一步研究微生物与传统治疗方法的联合治疗方案，最大程度地发挥人体微生物的作用。生殖道益生菌的开发和应用应受到鼓励，利用好生物工程技术研制出有效便捷的针对宫颈疾病的治疗性疫苗和生物性治疗制剂，也有利于宫颈疾病的防治和缓解全球抗生素耐药的严峻形势。