ADAR1与食管鳞状细胞癌病理特征及预后的关系

张振，李芳芳，王云龙，王同甫，梁冰，杨清乐，潘平

(南阳市第一人民医院 肿瘤内二科，河南 南阳 473000)

食管癌是危害全球人类健康的疾病之一，其发病率居于恶性肿瘤第9位，死亡率居于第6位[1]。我国2015年统计显示，食管癌年新发病例47.79万，预计死亡35.5万人[2]。我国食管癌高发于华北太行山脉地区，主要病理类型为鳞状细胞癌(简称鳞癌)，腺癌少见。近年来食管癌手术治疗有很大进步，但进展期食管癌预后仍然较差，5 a生存率低于10%[3]。部分研究显示一些指标与食管鳞癌预后相关，但都不是肿瘤特异性的，且受多种因素影响[4-7]。作用于RNA的腺苷脱氨酶1(adenosine deaminases acting on RNA 1，ADAR1)可催化双链RNA上的腺嘌呤转换为次黄嘌呤(adenosine-to-inosine，A-to-I)，并将次黄嘌呤识别为鸟嘌呤，与胞嘧啶配对。ADAR1的编辑活性与肿瘤的发生发展密切相关。本研究检测ADAR1在食管癌组织及癌旁正常组织中的表达，探讨其与食管鳞癌临床特征的关系及对预后的影响。

1 材料与方法

1.1 临床资料及标本收集南阳市第一人民医院2018年1—12月经手术切除的36例新鲜食管癌组织及距离原发灶5 cm以上的癌旁正常组织，收集2014年1月至2016年1月102例术后食管鳞癌蜡块。通过电话随访或返院复查，每3个月1次，记录患者生存情况，末次随访时间为2019年11月1日。病例纳入标准：术前未接受放化疗；手术为R0切除；病理类型为食管鳞癌；有完整的术后病理资料和临床资料。排除标准：腺鳞混合或其他病理类型食管癌；合并其他恶性肿瘤；术后出现吻合口瘘等严重并发症。本研究经南阳市第一人民医院医学伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器TRIzol Reagent(15596018)购自上海索莱宝生物科技有限公司，Superscript Ⅲ Reverse Transcriptase Kit(18080044)购自美国Invitrogen公司，SYBR Green qPCR Master Mix(QR-SG-M200)购自上海萨博生物公司，ADAR1兔抗人一抗(FNab00150)购自上海北诺生物科技公司，羊抗兔二抗(WE0383-BMR)购自北京中杉金桥生物技术公司，DAB试剂盒(HR0342)购自北京百奥莱博科技公司，ADAR1与内参GAPDH上下游引物由上海生工合成。实时荧光定量PCR仪QuantStudio DX购自Thermo Fisher Scientific。

1.3 RT-qPCR组织研磨后用TRIzol匀浆，加入氯仿进行相的分离，中间有机相析出后加入异丙醇进行RNA沉淀，加入体积分数75%的乙醇洗涤RNA，加入焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)水吹打溶解RNA，紫外分光光度计检测RNA光密度(optical density，OD)值，测定RNA水平，-80 ℃冰箱保存。提取的组织总RNA用Superscript Ⅲ Reverse Transcriptase Kit试剂盒进行逆转录，以逆转录的cDNA为模板，应用SYBR Green qPCR Master Mix Kit进行实时荧光定量PCR。ADAR1上游引物为5’CCCTTCAGCCACATCCTTC3’，下游引物为5’GCCATCTGCTTTGCCACTT3’，内参GAPDH上游引物为5’CATGAGAAGTATGACAACAGCCT3’，下游引物为5’AGTCCTTCCACGATACCAAAGT3’。扩增条件：95 ℃ 10 min预变性，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min共40个循环。采用相对定量法比较癌组织与癌旁正常组织表达水平，计算方法采用2-ΔΔCt法。

1.4 免疫组织化学法石蜡切片进行脱蜡和水化，30 g·L-1的H2O2浸泡10 min后冲洗，0.5 mol·L-1乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)缓冲液煮沸20 min进行抗原修复，滴加体积分数10%的非免疫山羊血清孵育20 min进行封闭，滴加一抗工作液，4 ℃过夜孵育，滴加特异性二抗工作液，37 ℃孵育30 min，DAB试剂盒显色，自来水冲洗，苏木精复染1 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。每个样本取 4 个高倍视野，通过免疫组织化学半定量检测得出阳性细胞百分比，以4个高倍视野均值为最终表达量。肿瘤组织的表达高于其相应正常组织的表达为高表达，低于或与相应正常组织表达水平相当为正常表达。

2 结果

2.1 ADAR1在食管鳞癌及癌旁正常组织中表达情况对36例新鲜食管鳞癌术后组织标本进行 RT-qPCR检测显示：ADAR1在癌组织中表达水平较癌旁正常组织高(t=2.271，P=0.026)，见图1。免疫组织化学检测显示：ADAR1在细胞质和细胞核中均有表达，在癌旁正常组织中呈弱阳性表达，在食管鳞癌中呈强阳性表达，见图2。对免疫组织化学结果进行半定量处理，与RT-qPCR检测结果进行Pearson相关性分析，结果显示二者呈正相关(r=0.806，P<0.01)。

图1 RT-qPCR检测ADAR1在食管鳞癌及癌旁 正常组织中的表达

A为癌旁正常组织，B为食管鳞癌组织。

图2免疫组织化学法检测ADAR1在食管鳞癌及癌旁

正常组织中的表达(苏木精染色，×200)

2.2 ADAR1表达与食管鳞癌临床病理特征的关系通过免疫组织化学检测发现ADAR1表达增高与食管鳞癌患者性别、年龄、肿瘤部位、长度、分化程度无关(P>0.05)，与肿瘤的浸润深度和淋巴结转移有关(P<0.05)。见表1。

表1 ADAR1表达与食管鳞癌术后临床病理特征的关系

2.3 ADAR1表达对食管鳞癌患者术后生存率的影响ADAR1高表达和正常表达患者中位总生存期分别为25、 39个月，差异有统计学意义(P=0.004)。见图3。

图3 ADAR1高表达与正常表达患者总生存情况比较

2.4 影响食管鳞癌患者术后总生存期的单因素和多因素分析将性别、年龄、部位、长度、肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况及ADAR1表达水平纳入预后分析。单因素分析显示：ADAR1表达水平、肿瘤浸润深度、淋巴结转移情况是患者预后的影响因素，ADAR1正常表达、T1～2、无淋巴结转移的患者总生存期较长(P<0.05)。多因素分析显示：ADAR1表达水平和肿瘤浸润深度是食管鳞癌患者术后总生存的独立危险因素(P<0.05)。见表2。

表2 影响食管鳞癌患者术后预后的单因素和多因素分析

3 讨论

ADAR1基因位于染色体1q，在哺乳动物大部分组织中均有表达，结构高度保守，包括3个双链RNA结合区和C端催化脱氨基结构区[8]。ADAR1介导的A-to-I RNA编辑活动与恶性肿瘤的发生发展密切相关。ADAR1可以作用于mRNA如AZIN1，增加肝癌和食管鳞癌细胞的侵袭性[9-10]，也可以作用于抑制肿瘤的miRNA如let-7家族，增加白血病干细胞的自我更新能力[11]。在多种肿瘤中，基因扩增是ADAR1水平升高的主要原因，同时也可以通过肿瘤慢性炎症刺激干扰素信号通路诱导其水平升高。在慢性髓系白血病中，JAK-STAT信号通路和 BCR-ABL1表达能够刺激干扰素信号通路，诱导ADAR1上调[11-12]，而JAK-STAT信号通路同样参与食管鳞癌ADAR1上调[13]。在细胞培养基和动物实验中，过度表达的ADAR1增强了肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而ADAR1基因的沉默或敲除能降低恶性特征。

本研究显示，不论采用PCR还是免疫组织化学方法，食管鳞癌组织ADAR1表达水平均高于癌旁正常组织，且免疫组织化学结果显示ADAR1表达水平与食管鳞癌的浸润深度和淋巴结转移情况有关，提示ADAR1可能为食管鳞癌发生发展的促进因素。既往研究表明，在肝癌、乳腺癌、前列腺癌等肿瘤中存在ADAR1高表达和更高频率的A-to-I RNA编辑现象，与肿瘤的发生、发展有密切关系[14-15]。食管鳞癌是我国最常见的食管癌组织学类型，占97%，腺癌不到2%，与西方国家明显不同[16]。食管鳞癌是环境、遗传因素等交互作用和多阶段演进的结果，DNA的突变和RNA的修饰均参与其发病过程。一些临床指标如中性粒细胞与淋巴细胞、血小板与淋巴细胞、C反应蛋白与白蛋白的比值以及D-二聚体水平等与食管鳞癌预后有一定的相关性[4-7]，但受影响因素较多，都不是肿瘤特异性的。本研究通过生存分析发现，ADAR1的表达与食管鳞癌预后相关，阳性组中位生存期较短，多因素分析显示ADAR1是食管鳞癌预后的独立危险因素，提示其可以作为食管鳞癌预后的评估指标。

本研究针对食管鳞癌预后的单因素分析发现淋巴结转移、肿瘤浸润深度、ADAR1表达情况均与患者预后相关，多因素分析中只有浸润深度和ADAR1是独立危险因素。通过分析相关临床资料，发现淋巴结清扫不足且未进行区域划分可能为部分原因。另外，本研究为回顾性研究，可能存在一定的偏倚。虽然在新鲜组织标本中，RT-qPCR和免疫组织化学法检测结果有很好的相关性，但由于前期新鲜组织标本收集不足，预后分析只能应用免疫组织化学法检测石蜡标本，与RT-qPCR方法可能会存在一定的差异。另外手术T分期中，T1和T4比例较少，可能对研究结果有一定的影响，这些均需在后续研究中改进。对于ADAR1在食管鳞癌中的作用机制，需要进一步研究阐释。