异甘草素对瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成的影响及机制

张慧娟，王 强，姚 放

瘢痕疙瘩是皮肤创伤愈合过程中，成纤维细胞过度增殖和细胞外基质尤其是胶原过度沉积导致的结果，又被称为结缔组织增生症。目前，临床瘢痕疙瘩治疗方法包括局部药物注射、手术切除、免疫调节药物治疗等多种方法，但治疗效果不佳，不能遏制其复发[1]。因此，探究瘢痕疙瘩发生发展的分子机制并寻找新的治疗方法尤为重要。异甘草素是甘草中的异黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等多种功效[2]。但目前，异甘草素能否影响瘢痕疙瘩成纤维细胞（keloid fibroblasts，KF）胶原的合成还未知。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类小分子单链非编码RNA，其通过与靶基因的3'非翻译区（3'untranslated region，3'UTR）特异性结合，在转录后水平降解靶mRNA或抑制靶mRNA翻译，负调控靶基因的表达，在瘢痕疙瘩的发生发展中起重要作用[3-5]。研究显示，miR-181a在人瘢痕组织和KF细胞中表达上调，下调miR-181a表达可抑制KF细胞的增殖并诱导细胞凋亡，是瘢痕疙瘩的潜在治疗靶标[6]。miR-181a-5p是miR-181a的成熟体，其对KF细胞胶原合成的影响还未知。Targetscan生物信息学软件预测显示，母亲DPP同源物7（mothers against decapentaplegic homolog 7，Smad7）可能是miR-181a-5p的靶基因。研究表明，上调Smad7表达可抑制KF细胞中Ⅰ型（Col-Ⅰ）和Ⅲ型（Col-Ⅲ）胶原的合成[7]。本研究旨在探讨异甘草素对KF细胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ胶原合成的影响，并以miR-181a-5p/Smad7轴为切入点，探讨异甘草素影响KF细胞胶原合成的分子机制，以期为瘢痕疙瘩的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 标本来源

组织来源于2017年12月—2018年4月沈阳市第七人民医院收治的瘢痕疙瘩患者，共10例，其中男4例，女6例，平均年龄（27.69±6.83）岁。患者局部无破溃和感染，无任何治疗史。经患者同意，自愿签署知情同意书。

1.2 主要试剂

异甘草素（纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司），DMEM培养基（北京索莱宝科技有限公司），RNA抽提试剂盒和LipofectamineTM2000试剂盒（美国Invitrogen公司），逆转录试剂盒和PCR试剂盒（深圳晶美生物工程有限公司），PCR引物（上海生工生物工程有限公司），鼠抗人 Col-Ⅰ和Col-Ⅲ抗体（美国Santa Cruz公司），兔抗人Smad7抗体（美国Abcam公司），miR-181a-5p模拟物及模拟阴性序列、miR-181a-5p抑制剂及抑制剂阴性序列、Smad7小干扰RNA及乱序无意义阴性序列（si-NC）和荧光素酶载体（上海吉玛制药技术有限公司），二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白检测试剂盒和双荧光素酶活性检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞分离和培养 参照文献[8]方法分离和培养KF细胞。磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗瘢痕疙瘩组织3次，手术剪剪碎，0.2%Ⅰ型胶原酶溶液37℃消化3 h。含10 % FBS的DMEM培养基终止消化，过200目筛网。将滤液收集到15 ml离心管，1 500 r/min离心5 min，弃上清。用培养液重悬细胞，接种于25 cm2培养瓶中，置于37℃、CO2体积分数5 %、湿度97 %的培养箱中培养。1周后，更换新鲜培养基，以后每2～3 d更换1次培养基。待细胞融合至80 %～90 %时，PBS清洗细胞，加入0.25 %胰蛋白酶溶液消化，进行传代培养。

1.3.2 Western blot法检测细胞中 Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和Smad7蛋白表达 KF细胞以每孔2.5×104个细胞接种于24孔板中，分为对照组（NC组）和异甘草素组。对照组细胞正常培养。异甘草素组细胞分别用含20、40、80 μmol/L异甘草素的培养基培养。培养24 h后，吸弃培养基，0.25 %胰蛋白酶消化，收集细胞。PBS清洗细胞后，RIPA蛋白裂解液提取细胞中总蛋白，BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度并进行定量。取一定量蛋白溶液，100℃煮沸5 min使其变性，然后以每泳道30 μg蛋白行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白分离后，电转移至聚偏乙烯二氟膜，于5%脱脂奶粉中封闭1 h。然后分别置于Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和Smad7抗体孵育液中，4℃孵育过夜。TBST洗膜后，置于辣根过氧化酶标记的二抗孵育液中，37℃孵育2 h。TBST洗膜后，滴加ELC显影液，避光显影后凝胶成像系统曝光拍照。以β-肌动蛋白为内参，Image J软件分析Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白的相对表达水平。

1.3.3 实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测miR-181a-5p和Smad7 mRNA表达水平 NC组和异甘草素组细胞培养24 h后，0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞。PBS清洗后，参照RNA抽提试剂盒说明书提取细胞中总RNA，微量核酸仪检测RNA的纯度和浓度。参照逆转录试剂盒将提取的RNA逆转录为cDNA，并以cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增条件：95℃预变性5 min，95℃变性 10 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共 40个循 环。miR-181a-5p上 游5'-CAAATTATTGTGGGT TGTC-3'，下 游 5'-TTATGGGTAGATGGGTGA-3'；Smad7 上 游5'-AGAGAAGGGACAAGGGGAAA-3'，下 游 5'-GCGGTGATTGCCTTGATATT-3'；U6上 游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游 5'-AACGC TTCACGAATTTGCGT-3'；GAPDH上游5'-CGGAGT CAACGGATTTGGTAT-3'，下游5'-AGCCTTCTCCAT GGTGGTGAAGA C-3'。miR-181a-5p以U6为内参，Smad7以GAPDH为内参，2-△△Ct法计算miR-181a-5p和Smad7 mRNA的相对表达水平。

1.3.4 细胞转染和分组培养 KF细胞以每孔1.0×105个细胞接种于6孔板中，当细胞融合至60%时，更换不含FBS的培养基。参照LipofectamineTM2000试剂盒说明书，分别将miR-181a-5p抑制剂（antimiR-181a-5p组）、抑制剂阴性对照（anti-miR-con组）、miR-181a-5p 模拟物（miR-181a-5p组）、模拟物对照序列（miR-con组）、Smad7过表达载体（si-Smad7组）、乱序无意义阴性序列（si-con组）转染至KF细胞。转染6 h后更换新鲜培养基。继续培养至48 h后收集细胞。

收集的各组细胞以每孔2.5×104个细胞接种于24孔板中。其中miR-con组和miR-181a-5p组细胞用含80 μmol/L异甘草素的培养基培养24 h，并分别记为异甘草素+miR-con组和异甘草素+miR-181a-5p组，其他各组细胞常规培养基培养24 h。细胞培养结束后，RT-qPCR检测细胞中miR-181a-5p表达水平，Western blot检测Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和Smad7蛋白表达，方法与1.3.2、1.3.3相同。

1.3.5 miR-181a-5p与Smad7靶向关系验证 使用PCR技术扩增含miR-181a-5p结合位点的Smad7的3'UTR序列，经XhoⅠ酶切后插入pGL3-Promoter载体中，构建Smad7野生型质粒（WT-Smad7）。并利用定点突变技术将结合位点突变后，经Xho Ⅰ酶切后插入pGL3-Promoter载体，构建Smad7突变型质粒（MUT-Smad7）。培养KF细胞，分别共转染WT-Smad7与miR-181a-5p mimics或 miR-con、MUT-Smad7与miR-181a-5p mimics或miR-con至KF细胞。转染6 h后，更换新鲜培养基。继续培养至48 h后，收集细胞。细胞裂解后，检测各组荧光素酶活性，具体操作参照双荧光素酶活性检测试剂盒说明书。

1.4 统计学方法

利用SPSS22.0软件分析实验数据。Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和Smad7蛋白表达水平及miR-181a-5p表达水平均以均数±标准差（）表示。两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 异甘草素对KF细胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ胶原蛋白表达的影响

与NC组比较，不同浓度（20、40、80 μmol/L）的异甘草素作用于KF细胞后，细胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ胶原蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）（图1）。

图1 异甘草素对KF细胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达的影响

2.2 异甘草素对KF细胞中miR-181a-5p和Smad7表达的影响

与NC组比较，80 μmol/L的异甘草素作用于KF细胞后，细胞中miR-181a-5p表达水平显著降低（P＜0.05），Smad7 的mRNA和蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）（图2）。

图2 异甘草素对KF细胞中miR-181a-5p和Smad7表达的影响

2.3 下调miR-181a-5p对KF细胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达的影响

与NC组或anti-miR-con组比较，anti-miR-181a-5p组KF细胞中miR-181a-5p表达水平显著降低（P＜0.05），而NC组与anti-miR-con组miR-181a-5p表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05），表明miR-181a-5p抑制剂转染成功，anti-miR-181a-5p组KF细胞中miR-181a-5p表达下调。与NC组或antimiR-con组比较，anti-miR-181a-5p组KF细胞上清中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ胶原蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05），而NC组与anti-miR-con组Col-Ⅰ和Col-Ⅲ胶原蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）（图 3）。

图3 下调miR-181a-5p对KF细胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达的影响

2.4 上调Smad7对KF细胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达的影响

与NC组或pcDNA-con组比 较，pcDNA-Smad7组 KF细胞中Smad7 mRNA表达水平显著升高（P＜0.05），而NC组与pcDNA-con组Smad7mRNA表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05），表明Smad7过表达载体转染成功，pcDNA-Smad7组KF细胞中Smad7表达上调。与NC组或pcDNA-con组比较，pcDNA-Smad7组KF细胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ胶原蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05），而NC组与pcDNA-con组 Col-Ⅰ、Col-Ⅲ胶原蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）（图4）。

图4 上调Smad7对KF细胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达的影响

2.5 miR-181a-5p靶 向 调 控Smad7的表达

Targetscan生物信息学软件预测显示，Smad7的3'UTR与miR-181a-5p存在连续的结合位点（图5A）。双荧光素酶活性检测结果显示，共转染WT-Smad7与miR-181a-5p mimics荧光素酶活性显著低于共转染WT-Smad7与miR-con的细胞（P＜0.05），而共转染MUT-Smad7与miR-181a-5p mimics的细胞荧光素酶活性与共转染MUT-Smad7和miR-con的KF细胞比较，后两者的KF细胞荧光素酶活性无显著变化（P＞0.05）（图5B）。miR-181a-5p组miR-181a-5p水 平 高 于 miR-con组 [（2.16±0.19）∶（1.03±0.05），P＜ 0.05]，Smad7蛋白表达水平显著低于miR-con组（P＜0.05），而antimiR-181a-5p组Smad7蛋白表达水平显著高于antimiR-con组（P＜0.05）（图5C）。

图5 miR-181a-5p靶向调控Smad7的表达

2.6 上调miR-181a-5p表达逆转异甘草素对KF细胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表达的影响

与异甘草素+miR-con组比较，异甘草素+miR-181a-5p组miR-181a-5p表达水平显著升高（P＜0.05），Smad7蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），Col-Ⅰ和Col-Ⅲ胶原蛋白表达水平均显著升高（P＜ 0.05）（图 6）。

图6 上调miR-181a-5p表达逆转异甘草素对KF细胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达的影响

3 讨论

异甘草素是甘草黄酮中的主要活性成分之一，具有广泛的药理活性。研究显示，异甘草素可通过抑制核因子（NF）-κB信号通路的活化有效降低人肺癌H460细胞的增殖，并诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡[9]；异甘草素可抑制低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增生，其作用机制与抑制活性氧族（ROS）的产生有关[10]。但目前，异甘草素对KF细胞胶原合成的影响还未知。本研究显示，异甘草素作用于KF细胞后，细胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ胶原蛋白表达水平显著降低，提示异甘草素可降低胶原沉积，具有开发为治疗瘢痕疙瘩药物的潜在价值。

miRNA可调控细胞的增殖、分化和凋亡等生命过程，在疾病的发生发展中起重要作用。研究已表明，miR-194-3p[11]、miR-124-3p[12]和 miR-188-5p[13]多种miRNA参与调控KF细胞的增殖和胶原合成，是瘢痕疙瘩治疗的潜在分子靶点。作为一种miRNA，miR-181a-5p参与多种疾病的发生发展。Liang等[14]研究显示，miR-181a-5p的过表达可靶向抑制下调kruppel样因子6的表达，从而抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖，且促进其凋亡，可作为糖尿病肾病的治疗靶标。但miR-181a-5p对KF细胞胶原合成的影响还未知。本研究显示，下调miR-181a-5p表达可降低KF细胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ胶原蛋白的表达；而异甘草素可降低KF细胞中miR-181a-5p表达，上调miR-181a-5p逆转了异甘草素对KF细胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ胶原合成的抑制作用，提示异甘草素可能通过下调miR-181a-5p来抑制KF细胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ胶原合成。

转化生长因子-β（TGF-β）/Smad信号通路参与瘢痕疙瘩的形成。Smad蛋白是TGF-β/Smad信号通路中的信号中介分子，可将TGF-β与其受体结合后产生的信号从细胞质传导至细胞核中，进而调节胶原蛋白的合成。有报道称，KF细胞中Smad7蛋白表达水平显著低于正常皮肤成纤维细胞，上调Smad7表达可抑制KF细胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ胶原蛋白表达[15,16]，这与本研究结果一致。本研究通过双荧光素酶报告基因及检测miR-181a-5p对KF细胞中Smad7蛋白表达的影响证实了miR-181a-5p靶向负调控Smad7表达。本研究还显示，异甘草素可促进KF细胞中Smad7表达，进一步提示异甘草素可能通过下调miR-181a-5p进而上调Smad7表达来抑制KF细胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ胶原的合成。

综上所述，异甘草素可抑制KF细胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ胶原的合成，其机制可能与下调miR-181a-5p进而上调Smad7表达有关。