侵袭性肺曲霉菌感染实验诊断新进展

高东田， 刘利华， 申爱华， 孙 寅

（济宁医学院附属医院检验科，山东 济宁 272029）

侵袭性肺曲霉菌感染（invasive pulmonaryAspergillusinfection，IPAI）是多发生于有免疫缺陷患者的全身感染性疾病。近年来，随着慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）和肿瘤发病率的持续上升，器官移植和各种导管侵入性操作的广泛开展，免疫抑制剂、糖皮质激素和抗肿瘤药物的普遍使用，IPAI呈上升趋势。IPAI较难诊治，患者病死率为55%～80%[1]，已引起临床的高度重视。IPAI往往因其症状轻微或缺乏特异性临床表现，且常与细菌性肺炎相混淆，很容易被漏诊和误诊。早期准确诊断和快速进行初始治疗，对改善患者预后、降低病死率有重要意义。探索IPAI诊断新技术已成为目前临床IPAI诊断的关注点。本文就IPAI实验诊断新进展进行综述。

1 组织病理学

组织病理学是IPAI诊断的金标准，采用免疫组织化学（简称免疫组化）方法，用标记的抗体或抗原对细胞或组织中的相应抗原或抗体进行定性、定位或定量检测，通过显色反应和显微镜进行观察。由于抗原、抗体的相对特异性和敏感性较高，可以做出相对特异性的诊断，常采用苏木精-伊红染色、嗜银染色、荧光染色等特殊染色；如见到隔菌丝和分生孢子头，即可判断曲霉菌感染。国外已制备出鼠抗烟曲霉单克隆抗体，一旦在临床样本和/或组织切片中发现曲霉菌菌丝和/或孢子，结合常用的曲霉菌染色和免疫组化特异抗体染色，即可对临床常见条件致病曲霉菌做出特异性诊断。马蕾等[2]采用免疫组化二步法对34例深部真菌病患者的临床样本用福尔马林固定，对石蜡包埋切片进行糖原染色和免疫组化标记，结果显示16例免疫组化染色为可疑曲霉菌感染的患者中有14例阳性，且菌体染色清晰、无背景（阳性率为87.5%）。证实了免疫组化二步法应用于深部曲霉菌感染检测具有高敏感、低背景和快速、简便的特点，在曲霉菌感染的临床病理学诊断中具有较好的应用价值。虽然病理样本经糖原或荧光染色有助于检测到曲霉菌特征性分支结构，但组织病理学检测为侵入性操作，且不能判断曲霉菌种类，如重症监护病房患者往往由于凝血功能障碍或存在急性呼吸窘迫综合征等肺活检的禁忌症，很难获得感染部位的病理学依据；另外，免疫组化检测成本高，抗体制备难，还可能出现假阳性或假阴性结果。

2 病原学

2.1 涂片镜检

对于痰液或支气管肺胞灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）等临床样本，涂片镜检是最简单、实用和直接的实验室诊断方法，也是最经典的检测方法之一。镜下查见45°分支分隔、粗细均匀的曲霉菌丝，菌丝反复分支呈放射状，偶见分生孢子，即可初步诊断为曲霉菌。痰液样本涂片镜检阳性率低，且易受污染，取自无菌部位的BALF涂片镜检的诊断价值较大，有研究发现，涂片镜检进行标准的特殊染色可提高阳性率[3]；有文献报道高危患者诊疗期间平均反复行痰涂片镜检真菌3.5次时，检测敏感性为87.7%、特异性为72.1%[4]。虽然临床样本直接镜检可见真菌寄生情况，可拟诊断为肺曲霉菌感染，但需注意的是镜下曲霉菌菌丝常与镰刀菌及足放线菌混淆，有时镜检阴性并不能排除活动性感染。

2.2 培养

IPAI可常规采用无菌肺部组织、血液和呼吸道分泌物样本（BALF和痰液）进行曲霉菌培养，其中肺部组织和BALF曲霉菌培养是诊断IPAI的金标准，阳性结果诊断价值较大，但耗时较长，且阳性率低，一定程度上限制了其早期诊断价值。司淑一[5]报道了不同临床样本培养阳性率：痰液为12%、BALF为40%～50%、血液为＜5%。当从痰液样本中培养出曲霉菌时，还需要判断是感染还是定植。欧洲癌症及真菌感染防治组织制定的IPAI判断标准仅针对免疫缺陷患者，而在重症监护病房，IPAI往往可见于没有曲霉菌感染的高危因素、缺乏典型症状及感染生物标志物阴性的病例，这种情况可采用无菌装置吸取气道分泌物进行曲霉菌培养，一项包括524家医疗机构重症监护病房的多中心观察性研究结果显示其敏感性较高（92%），并能更好地区分定植和感染[6]，值得推广应用。然而，IPAI患者呼吸道样本培养阳性率仅为61%[6]。除土霉菌外，血培养分离到曲霉菌往往被认为是污染，而非感染样本，常规的血培养很难诊断IPAI。因此，传统的曲霉菌培养对于分离和依据曲霉菌菌落形态及微观特性鉴别其种类至关重要。值得注意的是，培养阴性并不能排除活动性感染。

3 分子生物学

目前，诊断IPAI的分子生物学技术主要为曲霉菌核酸检测和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）。

3.1 核酸检测

近年来，采用曲霉菌通用引物对待检样本进行扩增，在短时间内检测微量的曲霉菌DNA；再采用属或种特异性引物对扩增产物进行二次扩增，进行分型和鉴定，通过对其18S、28SrDNA、 转录间隔区、细胞色素P-450、14-α脱甲基酶、角鲨烯环氧化物酶等目的序列进行分析，已设计出烟曲霉、孢子丝菌、皮炎外瓶霉和茄病镰刀菌的转录间隔区种特异性引物用于IPAI诊断。目前的分子生物学方法有巢式PCR、实时荧光定量PCR、光谱PCR和DNA测序、多重PCR、微阵列、光谱PCR电喷雾质谱技术、PCR-限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技术、随机引物扩增DNA多态性（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技术及基因芯片等，较大程度地增加了检测的灵敏度与特异性，为鉴别曲霉菌定植、感染及种属方面提供有益帮助。其中，巢式PCR采用全血/血浆定性检测烟曲霉菌DNA片段，可早期检出较低含量的曲霉菌，已被广泛应用。近年研究较多、最有前途的PCR技术是实时荧光定量PCR的LightCycler检测系统，WITTWER等[7]发现瑞士Roche公司的Lightcycler热循环仪将装载容量为20～25 μL的毛细硅管作为反应管进行扩增，光源选用冷光源系统，可以减少光源对样本的影响，由二极管发射蓝光激发荧光，并提供3个滤光片，可利用荧光分光测定的原理，同时对1个反应体系的多种荧光进行检测，完全可以进行多重PCR。这种LightCycler检测系统采用独特的毛细管反应体系和空气快速热循环系统，使样本能在非常短的时间内有效地实现温度变化，从而能在20～30 min内快速完成30～40个循环，达到样本扩增的目的。PAIVA等[6]采用实时荧光定量PCR检测真菌病原体核酸，敏感性为88%、特异性为75%，如联合检测半乳甘露聚糖（galactomannan，GM），特异性可达97%，特别适用于已经开始抗真菌治疗的患者。值得注意的是，PCR的方法学、标准和试剂可靠性对IPAI检测结果影响较大，不同方法的敏感性和特异性也有较大差异。因此，正确选择试剂和方法以获得良好的诊断符合率非常重要。朱利平等[8]推荐采用SeptiFast序列（瑞士Roche公司分子诊断工具）检测曲霉菌DNA，以基因序列分析结果作为曲霉菌鉴定的金标准，也可采用未经福尔马林固定的冷冻病理切片，或从活组织样本中提取的DNA，进行多种PCR分析。随着技术的不断完善，PCR有望成为更好的曲霉菌检测方法。

3.2 基因探针技术

曲霉菌核糖体RNA的碱基序列由可变区和保守区组成，利用保守区可设计通用探针，利用可变区可设计针对不同菌种的特异性探针。WANG等[9]用99mTc标记的探针靶向曲霉菌核糖体RNA，结合成像系统测序诊断IPAI，有望成为一种新方法。

4 IPAI相关生物标志物（靶物质）检测

非培养的曲霉菌（IPAI相关生物标志物）检测技术具有快速、简便、敏感性和特异性高的优点，为临床早期快速诊断IPAI、及时控制病情和评估预后具有重要意义。随着新的、更先进的GM试验及1，3-β-D-葡聚糖、穿透素-3（pentraxin-3，PTX-3）、细胞因子、醋酸镰孢氨酸C（triacetylfusarinine C，TAFC）、二甲硫基胶霉素（bis-methylthio gliotoxin，bmGT）、曲霉菌特异性抗体、曲霉菌特异性挥发性有机化合物（volatile organic compound，VOC）、D-甘露聚醇和铁载体/铁载体蛋白等生物标志物检测及特异性双糖质谱分析、免疫层析测流装置技术（immunochromatographic lateral-flow device，LFD）的发展，IPAI相关生物标志物检测有望成为IPAI实验室诊断的重要方法，是非常有发展潜力的IPAI诊断新技术[10]。

4.1 GM试验

4.1.1 血清/肺泡灌洗液GM检测 在曲霉菌侵袭组织早期，曲霉菌细胞壁外层的GM可被释放入血，此抗原可持续1～8周，在症状和体征出现前即可反映机体曲霉菌感染。2003年，美国批准GM试验用于血液病、肿瘤等免疫功能低下患者并发IPAI的诊断。临床常用试剂为曲霉菌抗原检测试剂盒，采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测GM，敏感性和特异性分别为86.3%和93.0%[1]，对IPAI的早期诊断和治疗监测更有价值，目前已被广泛应用。在高风险IPAI患儿的诊断中，GM试验敏感性为76%、特异性为86%，且对于血液病和造血干细胞移植患者更有诊断价值[11]。但是，有多种因素可能导致GM试验假阳性：（1）使用哌拉西林-他唑巴坦后，可能与交叉反应有关；（2）其他侵袭性真菌（青霉菌、镰刀菌、组织胞浆菌和球孢子菌）感染[11]；（3）服用其他抗真菌药物（除大扶康外）会导致GM假阴性结果；（4）血液病、恶性肿瘤患者，尤其是接受造血干细胞移植（可能与免疫正常宿主对侵入血管的曲霉菌清除有关）的非中性粒细胞减少患者中，因中性粒细胞介导的免疫反应会降低或清除循环中的相应抗原，血清GM水平几乎对曲霉菌感染没有诊断价值。相对于血清样本，采用GM试验检测BLAF样本，敏感性和特异性会更高，分别为75.68%和80.72%[12]，BALF GM检测对IPAI诊断意义较大。

4.1.2 尿液/脑脊液GM检测 对血液和BALF之外的其他体液样本，如尿液和脑脊液样本进行GM检测，对辅助临床诊断IPAI也可起到重要作用[13]。曲霉菌进入肺组织后，或当泌尿系统或全身性曲霉菌感染时，会释放GM进入肺组织、尿液和脑脊液。REISCHIES等[14]探讨了尿GM/尿肌酐检测诊断血液系统恶性肿瘤患者IPAI的价值，结果显示，当临界值为0.26时，检测敏感性为79%、阴性预测值（negative predictive value，NPV）＞98%、阳性预测值（positive predictive value，PPV）13%，表明尿GM/尿肌酐检测排除IPAI的价值较大，为IPAI的诊断提供了新思路。DUFRESNE等[15]采用免疫层析测流法和IgM单克隆抗体识别曲霉菌GM抗原，测定宿主尿液中的GM水平。我国关于尿GM/脑脊液GM检测的报道较少，有研究报道72只大鼠的尿液GM试验中，共5例阳性，敏感性为13.89%、特异性为100%[16]。尿GM检测敏感性低于血清GM检测，且GM在尿中出现较晚，早期诊断价值小，对尿液的GM检测影响因素包括GM动力学、肾脏清除率等，尿液GM检测假阳性率较高，其技术有待进一步改进[17]。10%～20%的IPAI患者脑脊液GM水平升高，脑脊液GM检测有助于早期诊断侵袭性中枢神经系统曲霉菌感染。

4.2 G试验

G试验常被用于判断IPAI的严重程度和疗效观察[18]。对血液或BLAF样本进行G试验，灵敏度可达1 ng/L，特异性也较高，分别为77.2%（血液样本）和78.3%（BLAF样本）[1]，但G试验阴性不能完全排除曲霉菌感染。与培养法相比，G试验所需时间较短且操作简单。但G试验无法检测隐球菌及接合菌感染，只能诊断真菌感染，无法确定真菌种类。有较多因素可致G试验假阳性：（1）正常人体定植的曲霉菌、白念珠菌等正常菌群及某些革兰阴性杆菌也可释放少量的1，3-β-D-葡聚糖入血；（2）某些药物，如头孢菌素类、氨苄西林-舒巴坦可影响检测结果；（3）行纤维素膜、白蛋白、免疫球蛋白治疗患者的样本，纱布或其他医疗物品（外科手术）及某些细菌败血症等因素。G试验早期诊断IPAI意义不大，用于病情监测和疗效观察效果较好。连续2次或以上与GM联合检测，对于早期诊断IPAI、提高阳性率有较高价值。

4.3 PTX-3检测

PTX-3是参与炎症急性期和免疫应答反应过程的保守蛋白中的一个亚家族，是Pentraxin家族（包括C反应蛋白、血清蛋白A）中被新发现的蛋白，也是急性时相炎症介质，感染后数小时便可被检出，属于炎症急性期反应蛋白。血液PTX-3水平与感染性疾病的发生、发展及病情的严重程度密切相关，被认为是炎症反应的重要生物标志物。有研究[19]发现，IPAI发生时，经适当刺激，肺部可产生PTX-3，血液中PTX-3水平会升高，对快速诊断曲霉菌感染有较高价值，而且可作为判断病情严重程度和预后评估的指标。采用双抗体夹心ELISA对血清/血浆/BALF样本进行检测，基于固相ELISA的原理，可以在3.5 h内迅速检测PTX-3水平。联合应用PTX-3、BALF GM试验或曲霉菌培养，可大大提高IPAI的诊断准确性。

4.4 TAFC检测

TAFC可介导感染过程中宿主铁的获取，是烟曲霉菌感染宿主后在转运铁过程中产生的一种分泌型小分子螯合剂，是一种新型标志物。ORASCH等[20]采用ELISA联合检测血液系统恶性肿瘤患者BALF样本中的GM和TAFC诊断IPAI，发现敏感性从单用GM试验的53%（以1.0为临界值）、73%（以0.5为临界值）分别提高到73%、87%，对于IPAI的确诊及排除诊断均有意义。但此项生物标志物的检验效果仍需更多研究结果加以证实。

4.5 bmGT检测

bmGT是曲霉菌胶霉素甲基化产生的一种更为稳定的代谢产物。VIDAL-GARCÍA等[21]发现，bmGT可在获得曲霉菌感染证据之前被检测到，且不存在于健康人群当中。可采用常规ELISA间接检测bmGT；为证实此结论，他们检测了90例疑似IPAI患者的357份血清中bmGT水平，结果显示敏感性为61.5%、特异性为93%、PPV为25.0%、NPV为98.5%。与GM联合检测，PPV和NPV分别为100%和97.5%。但血清中的bmGT存在时间短，易与组织和细胞整合而影响检测结果。

4.6 曲霉菌特异性IgG抗体检测

曲霉菌特异性IgG抗体是机体应对曲霉菌感染产生的特异性抗体，检测此抗体有助于IPAI的诊断。2013年，国际人类与动物真菌国际学会将血清曲霉菌特异性IgG抗体作为诊断变态反应性（过敏性）支气管肺曲霉病（allergic bronchopulmonary aspergillosis，ABPA）的首要条件。夏云等[10]采用荧光免疫酶法对IPAI患者血清中曲霉菌特异性IgG抗体进行检测，当以50 mmol/L为阈值时，其敏感性和特异性可达77%和78%。但因特异性抗体IgG是在曲霉菌感染机体一段时间后才出现在血清中的，所以此法不适于IPAI的早期诊断；另外，IPAI患者往往免疫功能低下，机体难以产生充分的免疫应答，血清特异性IgG水平可能低于检测限，提高该方法的灵敏度非常重要。AGARWAL等[22]的研究结果表明，烟曲霉特异性IgG抗体是诊断ABPA最敏感的检测指标，在国际上已被广泛应用。我国已开发出曲霉菌IgG抗体商品化试剂盒，此试剂盒需血清200 μL，检测方法为ELISA，检测值＜80 AU/mL为阴性，80～120 AU/mL为灰区，≥120 AU/mL为阳性，适用于慢性肺曲霉病（chronic pulmonary aspergillosis，CPA）及ABPA等曲霉菌感染的辅助诊断，可在临床实验室普及。

4.7 VOC检测

曲霉菌可产生特异性VOC，IPAI患者呼气样本中含有大量的VOC，是一种潜在的诊断标志物。VOC检测具有样本采集方便、无创、价廉、几分钟可出结果、可重复采集和不需患者主动配合等优点，但检测结果易受其他致病菌、肺疾病等多种因素影响。CHAMBERS等[23]采用色谱-质谱法确定了2-戊基呋喃是烟曲霉菌的特异性VOC，其他哺乳动物和大多数细菌的新陈代谢都不含有此种物质。曾秋琼等[24]发现VOC检测诊断烟曲霉感染的特异性为78%、敏感性为77%。电子鼻可用于替代检测VOC，当电子鼻的检测系统接触到呼出的气体时，其中的传感器会与不同的VOC反应，每种VOC都将形成一个特定的传感信号，这种诊断技术安全、无创、简单。HEINZ等[25]发现，此方法检测曲霉菌的敏感性和特异性分别为100.0%和83.3%。可见，VOC检测有望成为新的IPAI诊断方法。

4.8 D-甘露聚醇检测

D-甘露聚醇是曲霉菌生长过程中的特异性代谢产物，杨燕等[26]进行的动物实验结果显示，曲霉菌感染后D-甘露聚醇水平明显升高，提示D-甘露聚醇检测可间接诊断临床IPAI。但因D-甘露聚醇受曲霉菌属、感染机体中的生长状态、抗真菌药物、细菌或其他真菌生长抑制及人体代谢产物的影响，其在血清中水平变化较大，需要进一步研究，才能在临床开展。

4.9 铁载体/铁载体蛋白检测

铁载体是主要存在于细菌和真菌中，能合成并输出一种螯合铁的低分子复合物，通过铁载体和铁载体蛋白表达。曲霉菌在感染宿主细胞过程中会产生一种最具有杀伤力的曲霉菌毒素（铁载体蛋白），以保证其对铁元素的需求。曲霉菌毒素是曲霉菌在低铁应激条件下产生的相对分子质量较小的高铁离子特异性螯合剂，常用检测方法包括：（1）薄层层析法（thin-layer chromatography，TLC），针对不同的临床样本，用提取溶剂将曲霉菌毒素从样本中提取出来，经柱层析净化，再在薄层板上层析展开、分离，通过曲霉菌毒素的荧光性强弱，与标准比较而得出；（2）比色法，包括薄层色谱、气相色谱、液相色谱；（3）免疫化学（胶体金免疫层析法、ELISA）法，简便常用。

4.10 细胞因子检测

细胞因子由先天性免疫系统在抗真菌感染过程中分泌。曲霉菌感染后，机体的免疫活性细胞受真菌抗原刺激可释放白细胞介素（interleukin，IL）-8、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、IL-1β、IL-6和IL-10等。另外，曲霉菌抗原诱发Th2型免疫反应，产生IL-4、IL-5和IL-1等细胞因子。采用ELISA检测血清或BALF中细胞因子含量，可在临床症状出现之前发现细胞因子水平的升高。HELDT等[27]探讨了血清和BALF中细胞因子水平与IPAI的相关性，结果显示，IL-6和IL-8水平与IPAI存在相关性，当检测值较高时，对IPAI有诊断价值。胡晓艳等[28]报道了20例具有曲霉菌感染高风险的老年患者血清中IL-10水平降低，TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平均升高。提示ELISA检测血清细胞因子具有较好的敏感性和较高的特异性，能够快速、准确地检测到患者血清中具有显著意义的细胞因子。

5 质谱分析技术

5.1 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）

MALDI-TOF MS技术是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱技术，由基质辅助激光解吸电离离子源和飞行时间质量分析器2部分组成。AERNI等[29]的研究发现，这一新兴的生物质谱的组织成像技术对于发现疾病生物标志物具有重要意义。MALDI-TOF MS具有灵敏性、准确度、分辨率高及自动化、高通量及成本低等优点，越来越多地被应用于多个领域，并逐渐被用于曲霉菌感染的实验室诊断，通过检测特定蛋白指纹图谱，与数据库比对后识别特定曲霉菌，可鉴定到种的水平，是对多种曲霉菌进行常规鉴定的有效工具。MARTY等[30]以DNA测序为参考标准，应用飞行时间质谱系统鉴定319株临床丝状真菌，对曲霉菌的鉴定准确率为93.6%。张福军等[31]从IPAI患者临床样本中分离出曲霉菌后，提取用于MALDI-TOF MS鉴定的核糖体蛋白，保存于不同条件下，采用MALDI-TOF MS技术对其进行鉴定，比较不同保存条件下的鉴定结果，发现在4 ℃、-20 ℃和-80 ℃温度下保存鉴定正确率分别为97.73%、98.01%和97.73%。上述研究结果均表明，MALDI-TOF MS技术或可替代DNA测序，可大大缩短曲霉菌属鉴定时间，结果可靠，有利于早期抗曲霉菌治疗。

5.2 特异性双糖质谱分析技术

特异性双糖质谱分析技术是利用MALDITOF MS技术发展起来的可用于检测曲霉菌的一项新技术。曲霉菌侧流仪应用MALDI-TOF MS技术检测真菌感染时血清中生物标志物的特异性双糖可快速诊断IPAI，该方法具有简单、快速、通量高、成本低等特点。PAIVA等[6]对2018年重症监护病房潜在呼吸道感染患者的研究发现，特异性双糖质谱分析较G试验和GM试验的结果更可靠，适用于存在IPAI高风险患者的感染监控，其诊断价值优于G试验及BALF培养，与BALF-GM试验相似，特异性较高，但敏感性欠佳，且诊断特异性与是否开始预防性抗真菌治疗无关。由于特异性双糖质谱分析、GM试验、G试验检测的产物——双糖、GM、1，3-β-D-葡聚糖等几种生物标志物在真菌感染的不同时期水平有所不同，所以联合检测不同生物标志物可提高临床诊断效能。

6 LFD

THORNTON[32]在2008年发现了单克隆抗体MAb JF5，此抗体的特异性抗原是一种细胞外糖蛋白，这种糖蛋白主要存在于曲霉菌菌丝细胞壁、胞间隔和围绕细胞的荚膜层中，在曲霉菌快速活跃生长期连续分泌。LFD检测MAb JF5抗体可快速诊断IPAI，采用胶体金法，将单克隆抗体MAb JF5固定在醋酸纤维膜上，检测曲霉菌特定抗原成分，显色强度与该抗原浓度成正比，结果分阴性、弱阳性、中等阳性和强阳性，10～15 min即可判读结果。HOENIGL等[33]采集了78份BALF样本进行LFD检测，结果显示敏感性为80%、特异性为95%、PPV为80%、NPV为95%。PAN等[34]采用LFD检测患者血清，结果表明，LFD的检测敏感性为68%、特异性为87%。EIGL等[35]通过检测BALF，并与G试验和LFD联用，发现LFD检测IPAI的敏感性和特异性分别为94%和93%，提示采用胶体金法进行LFD检测或联合检测具有简便、快速和诊断准确的特点，有望用于临床常规检测。

7 联合检测

联合检测有不同组合模式，可不同程度提高IPAI的阳性诊断率、敏感性、特异性、PPV、NPV、准确性，降低漏诊率。

7.1 G试验联合GM试验

GM是一种曲霉菌细胞壁外层的多聚糖物质，曲霉菌侵袭组织早期，GM可被释放入血，且可持续1～8周，在症状和体征出现前即可反映出机体曲霉菌感染。有研究结果[1]表明，G试验诊断IPAI的敏感性为78.3%、特异性为77.2%、PPV为80.4%、NPV为74.9%、准确性为77.8%、漏诊率为21.7%；GM试验敏感性为86.3%、特异性为93.0%、PPV为91.4%、NPV为88.7%、准确性为89.9%、漏诊率为13.7%；检测敏感性、特异性和抗体量、受检人群、试验方法、判断标准、患者免疫状态均会影响G试验和GM试验的检测效能，因此2种方法联合检测可提高IPAI的检出率。于书娴等[36]关于G试验和GM试验对侵袭性真菌病诊断价值的Meta分析结果显示，联合试验敏感性为88%、特异性为81%，1种方法为阳性结果的敏感性优于2种方法均为阳性结果，特异性刚好相反；单独检测时，G试验和GM试验诊断效果相似；联合检测比单独检测有较高的诊断效果，且2种方法均为阳性时诊断效果最好。

7.2 GM试验联合痰培养

GM试验对早期诊治IPAI可起到积极作用，且血清样本采集方便。而传统的真菌培养方法存在阳性检出率低、耗时长、痰液样本易受污染等缺点。刘利华等[37]发现痰培养敏感性和特异性分别为60.4%和69.9%，GM试验敏感性和特异性分别为94.3%和94.5%，2种方法联合可将敏感性和特异性分别提高到98.1%和99.4%。

7.3 BALF-GM试验联合TAFC

ORASCH等[38]发现，ELISA联用BALF-GM试验与TAFC检测诊断血液系统恶性肿瘤患者IPAI的敏感性从单用GM试验的53%（以1.0为临界值）和73%（以0.5为临界值）分别提高到73%和87%，提示TAFC检测联合BALF-GM试验诊断IPAI效果更好。

7.4 BALF联合血清GM试验

有研究发现，联合检测BALF与血清GM诊断IPAI的敏感性、特异性、符合率均＞90%[39]。IPAI早期，血液中GM水平较低，且当宿主免疫功能正常时，中性粒细胞会提高GM清除率，因此，若患者免疫功能正常，血清GM检测在早期IPAI诊断中敏感性较差。肺部是曲霉菌感染的靶器官，其局部负载要显著高于其他体液，因此BALF GM试验能够较血清GM试验更准确、快速地诊断出早期IPAI。邓劲等[40]对206例临床高危非粒细胞缺乏IPAI患者进行血清GM试验，结果显示阳性93例，检测敏感性为89%、特异性为83%、PPV为86%、NPV为91%、约登指数为0.72、诊断符合率为78%。BALF GM水平均高于血清样本，阳性率也高于血清样本。提示BALF联合血清GM检测对IPAI更有诊断价值，优于单一样本单独检测，尤其对于免疫功能未知患者更有意义，可大大提高诊断效能。

7.5 PCR联合G试验或GM试验

PCR检测血曲霉菌DNA，可在极短的时间内检测到极微量的真菌DNA，报阳时间要早于G试验与GM试验。PCR的方法学、试剂的标准性和可靠性对结果影响较大，不同研究的敏感性和特异性差异较大；单独应用PCR诊断IPAI的敏感性和特异性分别为50%～100%和89%；单次PCR阳性的敏感性略高于单次GM试验阳性，特异性则显著性升高（P＜0.05）；2次PCR阳性敏感性与2次GM试验阳性相同，但是特异性显著性升高（P＜0.05）[5]。提示PCR对于IPAI诊断优于GM试验。《感染相关生物标志物临床意义解读专家共识》[13]指出，如果将PCR检测血曲霉菌DNA或G试验与GM试验结合起来，可提高诊断的准确性。BOCH等[41]对BALF样本进行GM试验和PCR联合检测，其诊断IPAI的敏感性和特异性分别为85%和97%，PPV为94%、NPV为90%。提示PCR检测血曲霉菌DNA联合血清学方法（GM试验）可以提高诊断的敏感性和特异性，优于单一检测。

7.6 LFD联合BALF-GM试验

GM试验操作较复杂、耗时长，而LFD操作简单（胶体金法）、检测时间较短（15 min），且在免疫缺陷宿主及非粒细胞缺乏宿主IPAI的检测中，均体现出较高的诊断价值。HOENIGL等[42]在诊断免疫缺陷患者IPAI时发现，BALF-LFD的敏感性、特异性、NPV和PPV分别可达到80%、95%、80%和95%。对BALF样本进行G试验和LFD试验联合检测的敏感性和特异性分别为90%和93%。EIGL等[35]发现LFD试验诊断IPAI的敏感性和特异性分别为94%和93%。于书娴等[36]发现BALFGM试验的敏感性为57%～88%、特异性为87%～95.8%；BALF-LFD的敏感性为77%～91%、特异性为83%～92%。LFD和BALF-GM试验联合检测可提高敏感性和特异性，具有更高的诊断价值，能够更好地满足临床需求。

8 总结

曲霉菌感染的诊断比较复杂，理想的诊断方法应具备快速、敏感、特异等特点。免疫组化是IPAI的金标准，可做出相对特异性的诊断，但取材为侵入性操作，且不能判断曲霉菌种类，成本高、抗体制备困难。涂片镜检和培养法阳性率低，且培养耗时长。G试验和GM试验易受患者病程等因素的影响；PCR的方法学、试剂的标准性和可靠性对结果影响较大。GM试验、G试验、PTX-3、细胞因子、TAFC、bmGT、曲霉菌特异性IgG抗体、曲霉菌特异性VOC、D-甘露聚醇和铁载体/铁载体蛋白等生物标志物检测及特异性双糖质谱分析、LFD诊断价值较高，操作更简单，获得结果时间更短，对诊治和监测IPAI意义更大，但统一标准化操作、临界值、试剂来源和标准有待深入研究。为了准确诊断IPAI，应将传统的形态学检查、培养法与非培养法结合起来，并联合多种诊断技术，包括临床诊断和病原学诊断技术等，以满足临床要求。