草莓根腐病土壤拮抗放线菌的筛选

陆铮铮 熊仕俊

摘 要：为获得草莓根腐病病原菌的拮抗放线菌，从草莓根围土壤中分离放线菌，采用平板对峙法筛选出了2株对草莓根腐病病原菌具有拮抗作用的生防放线菌。结果显示：同时对峙的平均抑菌直径分别是F3-8为20毫米、F2-2为17毫米;错时对峙的平均抑菌直径分别是F3-8为32毫米、F2-2为28毫米。

关键词：草莓根腐病;拟盘多毛孢属;拮抗;放线菌

草莓为蔷薇科草莓属多年生草本植物，富含维生素以及矿物质，营养价值高。中国是世界上种植面积最大、产量最高的草莓生产国[1]。随着草莓种植区的扩大，草莓病害对草莓产量及品质的影响也越来越严重，草莓根腐病就是其中一种危害较严重的病害。

草莓根腐病（Strawberry root rot）是一种典型的土传性病害，在世界各地的草莓种植区均有发生，能引起根部发生病变的病害，严重时产生缺株现象，影响草莓的生产，甚至出现绝产现象。草莓根腐病的致病菌有多种，其中由拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis）引起的草莓根腐病在国内常有报道[2]，且危害严重。

化学农药防治草莓根腐病成为传统的防治该病害的方法，但是农药对环境和人畜的危害较大。因此，笔者通过分离草莓根围土壤中的放线菌，采用平板对峙法将放线菌和草莓根腐病病原菌进行对峙培养，筛选出拮抗放线菌，进而研究无公害的绿色防治方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 草莓根腐病病原菌来源于安顺学院微生物学实验室，用PDA培养基培养扩大培养菌种备用。

1.1.2 土壤样品 采集于贵州省安顺市大寨村草莓种植地发生根腐病的种植区中健康草莓植株的根围土壤，共5份。

1.1.3 培养基[3] 病原菌的扩大培养：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）;土壤放线菌的分离：高氏合成1号培养基;土壤放线菌的纯化：燕麦粉培养基;平板对峙： 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离方法 采用组织分离法，将采回的草莓根腐病病株，用无菌水清洗发病的部位，选取新近发病部位一小块组织（0.5厘米×0.5厘米），经75%酒精消毒10～15秒后用无菌水洗3次，置于灭菌的放有滤纸的培养皿中，将组织表面多余的水分吸干，用灭菌的解剖刀和镊子将组织切成4～5毫米的小块，置于PDA培养基中培养，一个培养基可以放置3块病组织，置于28 ℃恒温培养箱培养3天后，进行纯化，采用柯赫氏法则确定病原菌，并采用形态学和分子生物学相结合的方法鉴定病原菌菌株。

1.2.2 土样采集方法 选取种植年限较长且发病较重的草莓种植地，采集健康草莓植株的根围土壤。取样时拨开表土约5厘米深，每样约50克（同地区取样点至少相距100米以上），装入自封袋并做上记号，带回实验室。

1.2.3 土壤放线菌分离方法 将采回的土壤放于干燥无菌的地方晾7天后进行分离。称10克土样置于盛有90毫升无菌水三角瓶中（瓶里放几粒无菌玻璃珠），用摇床充分振荡15分钟后静置10分钟。取1毫升悬浮液于9毫升无菌水中，再从中取1毫升于另一支9毫升无菌水中混匀，再稀释。如此类推就得到不同稀释倍数的土壤悬浮液（分离放线菌所需稀释倍数为10-2、10-3、10-4）。从各浓度的土壤悬浮液中吸取0.1毫升悬浮液分散滴于高氏合成1号平板上，再用灭菌的三角玻璃棒涂匀，静置20分钟后于32 ℃的恒温培养箱中倒置培养，待菌落形成后立即纯化并保存。

1.2.4 拮抗放线菌的筛选方法 （1）对峙培养：用灭菌的接种针挑取一小块放线菌置于PDA培养基的一侧，用打孔器将草莓根腐病病原菌制作成直径为5毫米的菌蝶，将菌蝶接种于PDA培养基的另一侧（培养基的直径为7.5厘米），置于32 ℃恒温培养箱中培养，3天后观察。（2）同时对峙：是将放线菌和病原菌同时接种于PDA中。（3）错时对峙：将放线菌接在PDA平板一侧，于28 ℃恒温培养箱培养，待放线菌已在培养基上定殖和产孢后（约7天），再接种病原菌于培养基的另一侧。（4）空白对照：培养基的一侧只接种病原菌，不接种放线菌。

1.2.5 抑菌直径的测量方法 抑菌直径=空白对照组平均生长出来的病原菌菌落直径-具有放线菌对峙的培养皿中的平均长出的病原菌菌落直径;平均抑菌直径=重复的抑菌直径之和/重复的次数。

2 结果与分析

从采集的5份健康草莓根围土壤中分离得到22株放线菌，经过平板对峙筛选得出2株对草莓根腐病病原菌具有拮抗作用的放线菌。其编号分别为F3-8、F2-2。2株放线菌对草莓根腐病病原菌的平均抑菌直径如表1所示;同时接种的平板对峙效果如图1所示;错时接种的平板对峙效果如图2所示。

由表1和图1、图2可以看出，无论是同时对峙还是错时对峙，这2株放线菌对草莓根腐病病菌都有一定抑制作用，其中 F3-8拮抗放线菌对草莓根腐病的抑制作用最佳。从同时对峙和错时对峙对比效果看，2株拮抗放线菌都是在错时对峙中发挥较大的抑制作用。

3 讨 论

通过分离草莓根围土壤中的放线菌，采用同时和错时的平板对峙法筛选出了2株拮抗放线菌，其结果为：同时对峙的平均抑菌直径F3-8为20毫米、F2-2为17毫米;错时对峙的平均抑菌直径F3-8为32毫米、F2-2为28毫米，病原菌在没有拮抗放线菌抑制的状态下，培养3天后，菌株直径可达61毫米，将拮抗放线菌共同培养后，病原菌的生长受到了明显的抑制，其中放线菌F3-8的抑制效果比放线菌F2-2的抑制效果更佳。同时结果还表明：2株拮抗放线菌均显示在错时对峙的抑制效果比同时对峙的抑制效果更好，说明放线菌需要在培养基上定植或产生抗生素之后对病原菌的抑制效果会更佳，因此在大田试验时，需要用拮抗放线菌的菌液浸根后移栽，这样效果最佳。

引起草莓根腐病的病原菌可达20多种，主要有镰孢属、疫霉属、炭疽菌属、丝核菌属、柱孢菌属、拟盘多毛孢属、终极腐霉属等真菌[4]。利用拮抗细菌和真菌对草莓根腐病的防治也常有报道，如姚锦爱[5]等报道的菌株 ZZBV-3 是草莓根腐病病原菌尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum 的优良拮抗细菌;王梦园报道[6]，筛选出了3株对新棒状拟盘多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora）引起的草莓根腐病病原菌具有较好拮抗效果的生防细菌。张鹤[7]报道的木霉菌对由茄腐镰孢菌（Fusarium solani）引起的草莓根腐病病原菌产生较强的抑制作用。但是，利用拮抗放线菌作为草莓根腐病病原菌拮抗菌的研究鮮有报道，因此笔者在本研究中筛选出的2株拮抗放线菌对草莓根腐病的生物防治研究具有重要的意义，为绿色防治提供了重要的生防菌株，后续将进一步开展这2株拮抗放线菌的鉴定和拮抗机制的研究工作。

参 考 文 献

[1]  张晓慧.草莓病害研究进展[J].安徽农学通报，2018，24（18）： 52-57.

[2]  刘艳茹.草莓拟盘根腐病病原菌鉴定及其防治药剂筛选[D].沈阳：沈阳农业大学.2020.

[3]  方中达.植病研究方法[M].北京：中国农业出版社，1998：46-49.

[4]  尹沙亮，钟珊，刘奇志，等.草莓丝核菌根腐病病原菌鉴定及7种杀菌剂的抑菌作用测定[J].植物保护，2019，45（4）：132-136.

[5]  姚锦爱，黄鹏，赖宝春，等.亿贝莱斯芽胞杆菌ZZBV-3的鉴定及其对草莓根腐病的防效[J].中国生物防治学报，2021，37（1）：172-177.

[6]  王梦园.草莓重茬病原菌的分离及其拮抗菌的筛选与应用[D].荆州：长江大学，2020.

[7]  张 鹤，杜国栋，宋亚楠，等.防治草莓根腐病的木霉菌筛选、鉴定及其防病效果[J].沈阳农业大学学报，2015，46（6）：654-660.