小麦黄花叶病毒病不同发生度土壤的微生物多样性研究

2018-01-09吴斌姜珊珊张眉辛志梅徐德坤王升吉辛相启

山东农业科学 2017年12期

吴斌+姜珊珊+张眉+辛志梅+徐德坤+王升吉+辛相启

摘要：2016年于山东省临沂市、枣庄市、济宁市采集3组小麦黄花叶病毒病发生严重度不同地块的土壤，采用平板稀释分离法分别分离其中的真菌、细菌和放线菌，统计土壤微生物总量及3种可培养微生物的种类和数量，研究其与小麦病毒病发生程度的关系。结果表明，同一地块中细菌数量占绝对优势，其次为放线菌，真菌最少；但是分离得到的可培养真菌的种类和数量最多，其次为细菌，放线菌数量最少；并且发病严重地块的土壤微生物总量均高于轻病地块，其中发病严重地块的真菌数量和种类增加的最为显著，其次为细菌，放线菌基本无变化。

关键词：小麦黄花叶病毒病；土壤微生物；真菌；细菌；放线菌；多样性

中图分类号：S154.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）12-0044-06

Abstract Three groups of wheat soil on that different degree of wheat yellow mosaic virus occurred were collected from Linyi，Zaozhuang and Jining in 2016. The fungi， bacteria， actinomycetes were isolated by plate dilution separation method.The total number of soil microorganisms， and the types and numbers of three cultured microbes were counted， which were used to study their relationships with the occurrence degree of wheat yellow mosaic virus. The results indicated that bacteria assumed absolute superiority in number， followed by actinomycetes， and fungi was the least in the same places.But the type and number of cultured fungi were the largest， followed by bacteria， and those of actinomycetes were the least. The total number of soil microorganisms of serious disease soil was higher than that of light disease soil； the kinds and number of fungi in the serious disease soil had the most significant increasing， followed by bacteria， and actinomycetes had almost no change.

Keywords Wheat yellow mosaic virus；Total number of soil microorganisms；Fungi；Bacteria； Actinomycetes；Diversity

病毒病是小麦生产上一类重要的病害，近年来有逐渐加重的趋势。我国发现的小麦病毒病有10多种，其病原主要是小麦黄矮病毒（Barley yellow dwarf virus，BYDV）、小麥丛矮病毒（Wheat rosette virus，WRSV）、小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus，WYMV）和中国小麦花叶病毒（Chinese wheat mosaic virus，CWMV）等[1]。小麦黄花叶病毒病是由禾谷多黏菌以持久性方式传播小麦黄花叶病毒引起的病害，近年来，该病害已成为山东冬小麦种植中的重要病害，在鲁西南地区发生尤为严重。2009年该病在山东临沂、枣庄等地突发，2013年的发病面积约6 670 hm2，2014年仅临沂市发病面积就多达 4 000 hm2，枣庄市发病面积3 333 hm2左右[2，3]。

研究表明，微生物可以直接参与土壤有机质的形成与养分转化，其数量和种类影响土壤生态系统的稳定性，是评价土壤肥力与健康的生物学指标[4，5]。于慧瑛等[6，7，10]对根腐病人参、枯萎病黄瓜和茎基腐病玉米植株根际土壤中的真菌种类及数量进行分析表明，发病植株根际土壤中的真菌和病原菌数量均有所增加，说明土传病害的发生与土壤微生态环境恶化、微生物群落结构失衡有紧密的联系。过去50年的大量研究表明，多种土传病毒是由土壤中的真菌或线虫传播。但是有关病毒病根际土壤微生物分布及其变化状况未见报道，本研究以小麦黄花叶病毒病发生度不同地块的根际土壤为研究对象，测定了土壤微生物的数量，并对三大微生物分别进行了分离、鉴定，以期了解发生小麦黄花叶病毒病的土壤微生物变化规律，为进一步研究及科学合理地利用微生物调控措施防治小麦黄花叶病毒病奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2016年3月分别于临沂市板泉镇葛家宅子村、枣庄市滕州市姜屯镇奚庄村、济宁市曲阜市小雪镇姜家村3地取样，每地根据小麦黄花叶病毒病发生严重程度选取轻病田与重病田2个取样地块，每个地块以5点取样法采集耕作层0～10 cm的土壤，每点选取5株植株的根际土壤各100 g，混匀，除去杂质等，立即进行试验。采样地块小麦品种均为感病品种临麦4号。

主要试剂：Easy Taq（5 U/μL）、10×Easy Taq Buffer、dNTPs （含Mg2+，2.5 mmol/L）均购自北京全式金生物技术有限公司，其他常规化学药品为分析纯试剂。试验所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。endprint

1.2 试验仪器

Mastercycler nexus PCR仪、Centrifuge 5430R 小型高速冷冻式离心机，德国 Eppendorf 公司；JY300基础型电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司；GelDoc-It 310 Imaging System凝胶成像系统，美国 UVP 公司；ZF-90紫外透射反射分析仪，上海骥辉科学分析仪器有限公司；AE224C电子分析天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 土壤微生物的分离培养与计数方法采用稀释平板法分离小麦根际土壤菌系。称取土壤样品1 g置于100 mL带有玻璃珠的灭菌水中，振荡均匀后稀释为不同浓度，在真菌培养基上稀释梯度为10-3、10-4、10-5，在放线菌培养基上稀释梯度为10-4、10-5、10-6，在细菌培养基上稀释梯度为10-5、10-6、10-7，在无菌环境下各吸取100 μL不同浓度的稀释溶液分别滴于真菌、细菌及放线菌选择性培养基平板上。真菌选用马丁氏培养基，制作平板前每100 mL培养基中加入1%链霉素0.3 mL；细菌选用牛肉膏蛋白胨培养基；放线菌选用改良高氏1号培养基，使用前每100 mL培养基中加3%重铬酸钾0.3 mL[7]。每个处理浓度重复3次，涂布均匀，晾干后真菌和放线菌平板于28℃、细菌平板于37℃黑暗倒置培养。

真菌培养2～7 d，细菌培养1～3 d，放线菌培养7～14 d，连续观察记录每皿各种菌的菌落数，直至同类微生物的菌落数不再增加为止。结果以每克干土所含数量表示。

同时待菌落长出后，分别挑取单菌落转接、纯化培养备用，并统计各微生物的优势菌属（平均出现频率>20%）[7]。

1.3.2 三种微生物基因组DNA的提取真菌DNA的提取：所有分离获得的真菌菌株经纯化培养，收集菌丝至2 mL的Eppendorf管中，用液氮迅速冷冻并研磨成粉末，采用HP Fungal DNA Kit（美国Omega公司）提取基因组DNA。

细菌DNA的提取[8]：分离得到的细菌菌株经单菌落纯化3次，挑取单菌落置于1 mL的LB培养液中，置于37℃摇床震荡培养4～24 h（220 r/min）；12 000 r/min离心5 min，弃上清，管底留约100 μL上清液与菌落沉淀混匀，置于沸水中煮3～5 min；小心吸取上清至1.5 mL Eppendorf管中。

放线菌DNA的提取[9]：取新鲜菌体于2 mL Eppendorf管中，液氮研磨至细粉状，加550 μL TE Buffer和20% SDS溶液（65℃預热）30 μL，漩涡振荡5 s，加入20 μL蛋白酶K（20 mg/mL），轻轻混匀后37℃保温1 h；加等体积酚+氯仿+异戊醇（25∶24∶1）抽提，轻微颠倒混匀，10 000 r/min离心10 min；小心吸取上清至1.5 mL Eppendorf管中，加等体积氯仿+异戊醇（24∶1）抽提，10 000 r/min离心5 min，吸取上清与等体积异丙醇（4℃预冷）混匀，10 000 r/min离心3 min，弃上清；沉淀用1 mL 70%乙醇（4℃预冷）洗涤1 min，自然风干后加入40 μL ddH2O溶解，-20℃保存备用。

1.3.3 菌株的鉴定利用rDNA-ITS通用引物ITS1（5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′）和ITS4（5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′），以及16S rRNA通用引物27F（5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′）和1492R（5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′）分别对3种微生物菌株进行扩增。ITS1/ITS4引物扩增反应程序：预变性94℃ 4 min，变性94℃ 30 s，退火56℃ 30 s，延伸72℃ 40 s，循环35次，72℃10 min；27F/1492R引物扩增反应程序：94℃ 4 min， 94℃ 30 s， 53℃ 30 s， 72℃ 2 min，循环35次，72℃10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，采用SanPrep 柱式DNA胶回收试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）对目的条带进行切胶回收，回收产物交由铂尚生物技术（上海）有限公司进行测序，获得序列在NCBI中进行Blast检索。

1.4 数据处理

试验数据整理与处理采用Microsoft Excel 2007完成，统计分析采用DPS（ver. 7.5）进行，并采用Duncans新复极差法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 土壤微生物的种类与数量

取样地块及其小麦黄花叶病毒病的发病情况见表1。

采用稀释平板涂抹培养计数法分析[10]土壤微生物数量，结果（表2）显示，每个取样点的土壤微生物数量均呈现细菌>放线菌>真菌的规律，并且每个取样地的重病田微生物总量均大于轻病田的。除枣庄外，其余两市重病田的真菌总数量均显著增加；三地重病田较轻病田细菌、放线菌数量均增加不显著。

2.2 土壤微生物多样性

对分离到的菌株进行扩增分析和鉴定，结果显示，引物ITS1/ITS4扩增条带大约为600 bp，27F/1492R引物扩增条带大约为1 400 bp，经测序、Blast检索比对，真菌鉴定结果见表3，细菌鉴定结果见表4，放线菌鉴定结果见表5。

试验共分离得到49株真菌菌株，临沂市轻病田共分离到半知菌类和子囊菌门两大类共5株真菌菌株，其中半知菌类包括3个属，分别为链格孢属2株，枝孢属和金孢霉属各1株；子囊菌门Paraphaeosphaeria属的1株真菌。临沂重病田共分离到半知菌类、子囊菌门、接合菌门三类真菌，半知菌类包括枝孢属、漆斑霉属、链格孢属、帚枝霉属及微座孢属5个属；子囊菌门包括球腔菌属、毛壳菌属、Paraphaeosphaeria属和地生梭孢壳属4个endprint

属；接合菌门包括2个属，分别为被孢霉属及毛霉属，每属各1株，共11株真菌菌株。枣庄市轻病田分离得到半知菌类及子囊菌门共8株真菌，其中半知菌类包括6个属，分别为漆斑霉属、戴氏霉属、平脐蠕孢属、帚枝霉属、枝顶孢属、肉座菌属，子囊菌门包括毛壳菌属及梭孢壳属，每属各包含1株真菌。枣庄重病田共分离得到12株真菌，分属于四个大类，分别为半知菌类，包括5个属，其中青霉属有2株，镰孢属、链格孢属、绿僵菌属及曲霉属各1株；子囊菌门包括3个属4株真菌，其中毛壳菌属2株，暗球腔菌属和隐囊菌属各1株，卵菌门的结合菌属及接合菌门的毛霉属各1株。济宁市轻病田共分离到4株真菌，其中半知菌类曲霉属、木霉属各1株，子囊菌门暗球腔菌属及接合菌门被孢霉属各1株。济宁重病田共分离到9株真菌，分属于三大类，其中半知菌类包括6个属，分别为镰孢属、链格孢属、曲霉属、平脐蠕孢属、漆斑霉属、枝顶孢属，每属各含1株真菌；子囊菌门包括2个属，分别为毛壳菌属和旋孢腔菌属各1株；接合菌门为1株毛霉属真菌。

对3组病样地块的优势真菌菌种统计可知，临沂市两地块的优势真菌属为链格孢属和枝孢属，枣庄市两地块的优势菌属为毛壳菌属，济宁市两地块的优势菌属为曲霉属。

试验共分离得到40株细菌菌株，其中临沂市轻病田仅分离到厚壁菌门1类，包括2个属，分别为芽孢杆菌属共4株，短芽孢杆菌属1株；临沂重病田分离到6株细菌，分别为厚壁菌门的葡萄球菌属2株及芽孢杆菌属1株、变形菌门的假黄色单胞菌属和寡养单胞菌属各1株、拟杆菌门的土地杆菌属1株，轻重病田的优势菌属为芽孢杆菌属。枣庄市轻病田共分离到两大类细菌，其中厚壁菌门全部为芽孢杆菌属，共6株，变形菌门包括3个属，分别为泛菌属、假黄色单胞菌属和戴氏菌属，每属各1株；枣庄市重病田也分离到厚壁菌门和变形菌门两大类细菌，其中厚壁菌门包括7株芽孢杆菌属和2株类芽孢杆菌属，变形菌门包含泛菌属的1株细菌，轻重病田优势菌属为芽孢杆菌属。济宁市轻病田仅分离到厚壁菌门细菌，包括芽孢杆菌属和短芽孢杆菌属各2株；济宁市重病田分离到厚壁菌门和变形菌门共6株细菌，其中前者包含芽孢杆菌属2株、短芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属各1株，后者包含寡养单胞菌属和多囊菌属各1株，轻重病田的优势菌属为芽孢杆菌属和短芽孢杆菌属。

试验共分离到34株放线菌。其中临沂轻病田共分离到2株放线菌，分别为诺卡氏菌科红球菌属和微球菌科节细菌属各1株；临沂重病田共分离到6株放线菌，分别为链霉菌科的链霉菌属2株、Microbacteriaceae科的微杆菌属和Plantibacter属各1株、微球菌科节杆菌属1株及间孢囊菌科海藻球菌属1株。枣庄轻病田共分离到链霉菌科链霉菌属6株和诺卡氏菌科红球菌属1株放线菌；枣庄重病田共分离到7株放线菌，分别为链霉菌科链霉菌属4株、放线菌科放线菌属1株、微球菌科节杆菌属1株及Pseudonocardiaceae科诺卡菌属1株。济宁轻病田共分离到链霉菌科链霉菌属4株及放线菌科放线菌属1株；济宁重病田共分离到7株放线菌，分别为链霉菌科链霉菌属3株、放线菌科放线菌属1株、Pseudonocardiaceae科诺卡菌属1株、皮生球菌科Flexivirga属1株及间孢囊菌科海藻球菌属1株。其中除临沂轻病田无明显的优势菌属，其余地块的优势菌属均为链霉菌属。

3 讨论与结论

土壤中细菌、真菌、放线菌三大微生物的数量是反映土壤活性和土壤健康的重要指标[11]。本研究以小麦黄花叶病毒病发生严重度不同地块的土壤作为对象，研究土壤微生物生态特征的变化情况。结果显示，同一地块中，土壤微生物总量表现为细菌>放线菌>真菌，这与李雪萍等[12]对青稞根腐病、徐瑞富等[13]对棉花黄萎病、苗则彦等[7]对黄瓜黄萎病、陆宁海等[10]对玉米茎基腐病的研究结论相同，但是分离到的可培养微生物数量及种类呈现真菌>细菌>放线菌的规律。张爱梅[14]对沙棘属植物可培养微生物的研究结果表明，真菌的个体数量虽然比细菌、放线菌少，但其生物总量却远大于细菌和放线菌，这可能因为一些细菌由于特殊的生物特性而不容易得到纯培养。

本研究结果还表明，3组重度发病土壤的土壤微生物总量均大于轻度发病土壤的，其中真菌数量增加最为明显，其次为细菌，放线菌变化不大。徐瑞富[13]、顾美英[15]等的研究表明，重度发生棉花黄萎病的地块中真菌数量明显高于轻度发生棉花黄萎病的地块，与本研究结果一致。真菌一般耐受性强，当细菌和放线菌发育受到限制的时候，真菌仍能较好地发育生长[14]，这可能是重病田真菌数量与种类远高于轻病田的原因之一；另外，该研究结果表明轻病田的放线菌数量明显高于重病田，与本研究不一致。本研究中小麦黄花叶病毒病重度发生的地块微生物数量增多，说明土壤质量下降，土壤环境的改变诱发各种微生物的生长和繁殖，同时病原微生物的大量繁殖也可能侵入寄主后改变植株生理代谢，造成其分泌物中一些成分及含量发生变化，从而可能导致不同发病程度的土壤微生物数量及种类明显不同。

参考文献：

[1] 王锡锋，刘艳，韩成贵，等. 我国小麦病毒病害发生现状与趋势分析[J]. 植物保护，2010，36（3）：13-19.

[2] 吴斌，姜珊珊，张眉，等. 山东省小麦生产品种对小麦黄花叶病毒病的抗性[J]. 麦类作物学报，2017，37（3）：332-336.

[3] 赵玖华，徐德坤，尚佑芬，等. 山东省小麦黄花叶病的突发与防控措施[J]. 山东农业科学，2012，44（10）：95-97，100.

[4] 何杰，李冰，王昌全，等. 不同控释氮肥比率对土壤无机氮、微生物及小麦生长的影响[J]. 麦类作物学报，2017，37（3）：349-356.

[5] 周丽霞，丁明懋. 土壤微生物学特性对土壤健康的指示作用[J]. 生物多样性，2007，15（2）：162-171.

[6] 于慧瑛，吕国忠，孙晓东，等. 病健人参根际土壤真菌种类及数量的研究[J]. 安徽农业科学，2007，35（26）：8279，8291.

[7] 苗則彦，赵奎华，刘长远，等. 健康与罹病黄瓜根际微生物数量及真菌区系研究[J]. 中国生态农业学报，2004，12（3）：156-157.

[8] 冯广达，陈美标，羊宋贞，等. 用于PCR扩增的细菌DNA提取方法比较[J]. 华南农业大学学报，2013，34（3）：439-442.

[9] 李秀萍，阿力木江，吾甫尔·米吉提. 一株具有抗菌活性的水浮莲内生放线菌的鉴定[J]. 新疆农业科学，2010， 47（7）：1370 -1375

[10]陆宁海，吴利民. 健康与罹病玉米根际微生物数量及真菌区系研究[J]. 玉米科学，2007，15（5）：136-138.

[11]姚槐应，黄昌勇. 土壤微生物生态学及其实验技术[M]. 北京：科学出版社，2006.