祁连山地区药用植物根际产功能酶放线菌的筛选

李增政　曹雪莲　韦瑶　常永芳

摘 要 本研究旨在探讨祁连山地区8种药用植物根际放线菌的产酶特性，以筛选功能酶产生菌，为后续研究提供参考菌种。采用含有75ug|/mL重铬酸钾和2ug/mL青霉素的甘油精氨酸琼脂培养基，并对土样做了120℃x 1h的加热预处理，利用稀释平板涂布法对8种药用植物根系土壤样品进行分离。之后利用7种筛选培养基对所得菌株定性检测，从祁连山地区所得的8种药用植物根际土壤样品中获得18株放线菌，功能酶筛选结果表明：10株放线菌产淀粉酶，14株产蛋白酶，14株产脲酶，18株产过氧化氢酶，4株产聚氧乙烯山梨酸醇单月桂酸酯酶，8株产聚氧乙烯山梨酸醇单油酸酯酶，15株产聚氧乙烯山梨酸醇脂肪酸酯酶，0株产色氨酸酶，0株产纤维素酶。有两株菌产H2S，18株放线菌在糖代谢过程中均无有机酸产生。

关键词 祁连山 植物根际 放线菌 功能酶

0前言

胞外水解酶诸如淀粉酶、蛋白酶、脂酶等在食品业、饲料添加剂、生物医学科学及化工工业等行业具有潜在的应用价值。工业生产一般是在特殊的物理化学条件下进行的，而在这个过程中起重要作用的酶制剂需要合适的反应条件才能达到最佳酶活，然而通常情况下这种最佳反应条件很难达到。因此寻找能够适应特殊环境条件的酶制剂是关键。放线菌是一类能够产生多種生物活性物质的微生物资源，如酶、抗生素、氨基酸、维生素、有机酸、生物碱等均由其产生。

植物根际是指生物和物理特性受到植物根系影响的紧密环绕根部的区域。在植物根际区域内生长的微生物称为根际微生物。因此，植物根际微生物是一类值得深入研究与开发的微生物资源，从根际微生物的代谢产物中寻找各种生物活性物质是改善工业生产条件的又一重要途径。

目前，还没有针对我国祁连山地区药用植物根际放线菌资源的研究报道，本文采用了稀有放线菌资源选择性分离方法，对采自祁连山地区不同海拔梯度、不通植被类型的不同药用植物根系土壤放线菌进行分离，并对所得菌株做了部分生理活性测定，对功能酶产生菌做了筛选。

1 材料与方法

1.1土样来源及处理

2010年7月下旬从祁连山地区选取7个不同植被类型、不同海拔梯度的样区，采集到29份代表性植物的根际土，各约100g，分装于自封袋中，贴上标签后带回实验室，以供分离放线菌之用。土样概况及药用植物的药理功能见表1。

1.2 菌种分离

1.2.1 分离培养基

培养基采用甘油精氨酸琼脂：精氨酸2.0g；NaCl 50g；甘油 12.5g； FeSO4 7H2O 0.01g；MgSO4 7H2O 0.5g；K2HPO4 1g；CuSO4 5H2O 0.0001g；ZnSO4 7 H2O 0.0001g；MnSO4 H2O 0.0001g蒸馏水1000mL；琼脂20g；调节pH至8.0以上。

1.2.2 分离方法

称取3g土样于120℃干热处理1h，用27mL6%的酵母提取物溶液和270ul5%的SDS溶液的混合液作为土样提取液。采用稀释涂布平板法进行分离。

1.3 代谢产物测定

1.3.1 MR实验

培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，K2HPO4 5g，蒸馏水1000ml。

1.3.2 硫化氢的产生

柴斯纳培养基：蛋白胨10g，柠檬酸铁0.5g，蒸馏水1000ml，pH7.2，121℃灭菌20min。

1.4 功能酶产生菌的筛选

1.4.1 色氨酸酶

培养基：1%胰胨水溶液，调pH7.2～7.6，分装1/4～1/3试管；115℃灭菌30min。

试剂：对二甲基氨基苯甲醛8g，乙醇（95%）760ml，浓HCl160ml。

1.4.2 过氧化氢酶

试剂：配3%～10%过氧化氢溶液

1.4.3 脲酶

培养基：蛋白胨1g，NaCl5g，葡萄糖1g，KH2PO4 2g，酚红0.012g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH6.8～6.9（微黄）。121℃灭菌20min。

试剂：30%的尿素，用乙醚消毒。待培养基冷至55℃时将无菌尿素加入，使尿素终浓度为2%。

1.4.4 脂酶

培养基：蛋白胨1g，NaCl 5g，CaCl2 ·7H2O 0.1g，琼脂9g，蒸馏水1000ml，pH7.4，于121℃灭菌20min。

底物：吐温-20、吐温-40、吐温-80分别于121℃灭菌20min。

1.4.5 蛋白酶

培养基：蛋白胨5g，葡萄糖20g，明胶200g，蒸馏水1000ml。

1.4.6 淀粉酶

淀粉水解培养基：可溶性淀粉10g，K2HPO4 0.3g，MgCO3 1g，NaCl 0.5g，KNO3 1g琼脂粉20g；蒸馏水1000ml；pH7.2～7.4。

1.4.7 纤维素酶

纤维素水解培养基（pH7.2）：MgSO4 0.5g，NaCl 0.5g， K2HPO4 0.5g， KNO3 1g；蒸馏水1000ml，滤纸条。

2 结果

2.1 代谢产物测定结果

01、16 两株菌产生硫化氢，所有菌株MR实验皆为阴性。

2.2 功能酶产生菌筛选结果

3 结论

本研究对祁连山地区8种药用植物根际土壤中分离到的18株形态各异的放线菌做了代谢产物测定和功能酶菌株筛选，检测结果发现18株放线菌中有10株放线菌产淀粉酶，14株产蛋白酶，14株产脲酶，18株产过氧化氢酶，4株产聚氧乙烯山梨酸醇单月桂酸酯酶，8株产聚氧乙烯山梨酸醇单油酸酯酶，15株产聚氧乙烯山梨酸醇脂肪酸酯酶，0株产色氨酸酶，0株产纤维素酶。其中菌株QL15除不产纤维素酶和色氨酸酶外，同时产其他7种酶。有两株菌产H2S，18株放线菌在糖代谢过程中均无有机酸产生。

项目来源：西北民族大学2016年本科生科研创新项目，项目编号：UPIP16222。

参考文献

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