长链非编码RNA与先天腭裂畸形的关系研究进展

唐璟，宋庆高

腭裂是常见的颌面部先天缺陷，可单独发生，也可与唇裂合并或作为遗传综合征的一部分出现。腭裂与唇腭裂由于病因及胚胎发育起源的相似性而密切相关。腭裂患者因腭部裂隙及腭咽闭合不全，导致严重的语音、饮食障碍及颌骨发育不良。给患者及家庭带来巨大的心理和经济负担。目前，腭裂的潜在病因尚未明确，先天缺陷的形成机制尚不清楚。研究认为，腭裂是复杂的多基因遗传因素与环境因素共同作用的结果［1］。胚胎腭突间充质细胞(embryo palatal mesenchymal cell，EPMC）的分化增殖和正中嵴上皮细胞（medial edge epithelial cell，MEEC）的转归是腭突融合的关键步骤。特定的信号通路和基因表达通过与细胞间的信息交流控制着腭突融合的每一步。腭部的发育需要对基因表达进行精确的时空调控，这是由错综复杂的转录因子网络及其相应的DNA 基序控制的。任何对此网络的微小干扰都可能导致腭裂的发生。非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）在腭发育过程中扮演着重要的角色。对全基因组关联研究（genome-wide association study，GWASs）数据进行分析时发现，80%以上的疾病相关遗传位点位于蛋白质编码基因之外［2］，这表明非编码基因在腭裂的发生发展中起着重要作用。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是非编码RNA中重要的一类，与腭裂的发生密切相关。lncRNA 可发挥竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）功能，其与微小 RNA（microRNA，miRNA）结合形成的 lncRNA-miRNA 表达模式在唇腭裂与正常的组织细胞中有着显著差异，提示它们可能通过参与调控某些生物过程的特定靶基因和信号表达，从而在唇腭裂的形成和调控机制中发挥重要作用［3］。本文将在现有研究的基础上对与腭裂有关的lncRNA 作用机制及lncRNA-miRNA 相关调控网络进行综述，旨在为腭裂的发病机制研究提供新的参考和视角。

1 上腭的发育过程

腭部组织可分为前腭突与侧腭突，前腭突源于原始口腔前界的胚胎额鼻突，而侧腭突则由原始口腔两侧的上颌突生长形成，在腭突发育初期，未分化的EPMC 可大量增殖。此时的舌体发育很快，几乎充满原始口腔，使最初向中线方向生长的两侧腭突只能向下垂直生长，位于舌的两侧。随后，由于下颌骨的生长发育及腭突体积增大等因素，舌体的形态逐渐扁平，侧腭突上升到舌背上方的水平位置，并向中线生长，两侧腭突开始接触，并与前腭突和鼻中隔相融合。在双侧腭突发生接触后，通过MEEC 的迁移、自噬、凋亡及上皮-间充质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT），其紧密粘连形成正中上皮带（medial epithelial seam，MES），随后MES逐渐变薄形成上皮条索，而条索断裂后成为上皮岛，最终完全消失，形成完整的口腔顶部［4-5］。由上可知，腭部的发育有着精确的时空顺序，对其发育过程任何环节的干扰都可能引起腭裂的发生。

2 LncRNA及竞争性内源RNA概述

LncRNA 是长度大于200 个核苷酸的非编码RNA，其能以多种调节方式参与胚胎发育、细胞的增殖分化和疾病的发生发展［6］。LncRNA 主要通过以下3 种方式参与基因网络调控［7］。（1）转录水平。部分lncRNA基因在自身转录时，可干扰下游基因的转录，从而影响mRNA 的生成，调控蛋白编码基因表达。（2）转录后水平。lncRNA 可作为 ceRNA 与miRNA结合，在转录后水平间接调节miRNA参与的生物学过程。（3）表观遗传学水平。lncRNA 可影响基因甲基化修饰，调控下游基因表达。

曾有学者提出了ceRNA 假说来解释lncRNA、miRNA和mRNA之间的作用，认为lncRNA拥有类似miRNA反应元件，可以作为ceRNA与miRNA竞争性结合，降低miRNA 对靶基因mRNA 的抑制作用，从而调节编码基因的表达水平，形成跨转录组的大规模调控网络［8］。因此，lncRNA与miRNA的相互作用关系逐渐成为研究热点，其ceRNA-miRNA-mRNA模式反映了不同RNA之间的调节对话新方式，极大拓宽了人类基因组遗传信息的功能，并在胚胎生长发育、疾病发生转归等生理、病理过程中发挥重要作用［9-10］。

近年来，对 lncRNA、lncRNA-miRNA 调节轴的探索主要集中于肿瘤等疾病领域，相关研究结果预见其可作为生物分子标志物对肿瘤的早期筛查、诊疗和药物使用有较大帮助［11-12］。目前，先天性发育畸形的患病率仍然很高，但有关lncRNA-miRNA 调节轴在胚胎生长发育方面的研究报道却较少。非编码RNA 对颅面发育有重要的调节作用，lncRNA、miRNA 均可调控细胞增殖、分化等相关生物过程，且它们的调控可相互依存、相互交织，共同形成复杂而精细的调控网络以参与颅面的发育［13-14］。显然，lncRNA-miRNA在先天发育畸形领域的作用有待更深的挖掘。

3 LncRNA导致腭裂发生的机制

目前，越来越多的证据显示，lncRNA 在胚胎生长发育的生物过程中发挥重要作用，人类异常的lncRNA 表 达 可 导 致 多 种 疾 病 发 生 发 展［15-16］。lncRNA 可通过调控腭发育过程中的关键基因影响细胞的分化增殖、凋亡迁移及相关生物过程，从而在腭裂的发生发展中发挥重要作用。

3.1 LncRNA 调控腭胚间充质细胞的分化增殖 EPMC 的分化增殖是腭突生长的关键。抑制EPMC的增殖可使腭架的生长延缓，甚至停滞，无法接触融合，从而导致腭裂的发生。LncRNA H19 在多种组织细胞中表达，与大多数疾病密切相关。在全反式维甲酸（atRA）诱导的腭裂小鼠模型中，lncRNA H19 与其靶基因胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF2）表达呈显著的负相关，IGF2是胚胎发育过程中组织细胞增殖和分化所必需的生长因子，lncRNA H19 通过调控IGF2抑制EPMC 增殖，进而抑制腭突的上抬及水平生长［17-18］。Gao等［19］在对2，3，7，8-四氯二苯并-二噁英（TCDD）诱导的腭裂小鼠研究中同样发现，lncRNA H19高表达可抑制IGF2基因，他们认为lncRNA H19 和IGF2的甲基化状态可能发生了改变，其异常表达可抑制EPMC的增殖，延缓腭架的生长，从而导致腭裂的发生。LncRNA Meg3 可通过转化生长因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）/Smad 信号通路来调节细胞的增殖、分化和相关生物过程［20］。在 atRA 处理的 EPMC 中，lncRNA Meg3 启动子中特定的CpG 位点去甲基化，使得lncRNA Meg3 表达上调，通过负调控Smad2蛋白信号的表达而抑制EPMC的分化增殖，进而抑制腭突的生长［21］。

3.2 LncRNA影响EMT EMT是腭突融合的重要过程，也是腭形成过程中的关键步骤。TGF-β 信号通路已被证实可广泛参与腭突的融合过程，其调控的关键因子Smad和Snail在EMT过程中发挥着重要作用。研究发现，lncRNA H19可在TGF-β3基因缺失后的腭裂形成中通过Smad 信号途径调控EMT 和细胞凋亡来阻碍腭突的融合［22］。可见，lncRNA H19在腭发育的各个阶段都发挥着重要作用。在TCDD诱导的腭裂小鼠模型中，对子代腭裂组织进行高通量测序并且构建lncRNA和mRNA的共表达网络，结果发现显著差异表达的7 个lncRNAs 在骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信号通路中富集；BMP信号通路与腭裂形成密切相关，是TGF-β超家族的成员，其同样作用于下游Smad 蛋白，影响EMT过程；该研究发现LncRNA ENSMUST00000193657、MSTRG. 56310.1、MSTRG. 13399.1 上 调 ，LncRNA MSTRG.51656.1、MSTRG.40182.1、MSTRG.38487.1、MSTRG.1991.1 下调，可能通过靶向结合Smad1和Smad5抑制EMT作用，从而诱导腭裂发生［23］。

3.3 LncRNA参与细胞的自噬和凋亡 细胞的自噬和凋亡参与腭部的发育。AMBRA1基因处于自噬和凋亡之间，控制自噬和凋亡之间的相互转换，决定细胞的死亡或存活［24］。Shu 等［25-26］发现一个与腭裂相关的lncRNA NONMMUT034790.2-LEF1-AMBRA1反式调节网络共表达下调，其中淋巴增强因子1（lymphoid enhancement factor 1，LEF1）参与腭裂的形成，可与Smad3显著富集于EMT 的生物学过程。AMBRA1 介导的自噬促进EMT 的诱导，而TGF-β/Smad3信号通路在调节自噬诱导的EMT中起着关键作用。AMBRA1调控NONMMUT034790.2 通过这一反式调节网络介导EMT相关的自噬和凋亡，可能是腭裂融合功能障碍的重要机制。转录因子LEF1可调控lncRNAs 和基因表达，形成NONMMUT034790.2-LEF1-Smad7 共表达反式调节网络［27］。其中Smad7可通过Wnt 信号中的转录调节因子与LEF1相互作用，并通过TGF-β 通路诱导细胞凋亡，参与EMT 过程。lncRNA NONMMUT034790.2、LEF1、Smad7可能在“lncRNA-TF-靶基因”的反式调节机制下介导MEEC的凋亡，抑制EMT作用，从而导致腭突融合失败。由上可知，lncRNA NONMMUT034790.2-LEF1-Smad7 共表达反式调节网络与腭裂的形成有关，lncRNA NONMMUT034790.2 可能成为腭裂新的表观遗传标志。

4 LncRNA作为ceRNA在腭裂中的表达研究

LncRNA 作为 ceRNA 可与 miRNA 相互作用，形成lncRNA-miRNA 调节轴，通过相关信号通路及与基因的相互作用来参与腭部发育，从而影响腭裂的发生发展。

4.1 动物实验研究 Prkar1α 是编码蛋白激酶A（PKA）的一个调控亚基，可在胚胎发育过程中调节神经嵴细胞的形成、迁移和分化，影响颅面的发育，参与cAMP 依赖性蛋白激酶活性的负调节途径［28］。研究报道，在atRA诱导的腭裂小鼠模型中通过生物信息学分析确定了69个lncRNAs、18个miRNAs和78个mRNAs 的异常表达，其中NONMMUT004850.2、NONMUT024276.2和Prkar1α表达上调，而miR-741-3p和miR-465b-5p表达下调［29］。通过构建ceRNA网络 功能 分 析，Shu 等［29］认 为 NONMMUT004850.2/NMMUT024276.2 作为 miR-741-3p/miR-465b-5p 的ceRNA 可通过调控 Prkar1α 表达，负调节 PKA 活性，从而阻断腭突融合，NONMMUT004850.2/NMMUT024276.2-miR-741-3p/miR-465b-5p-Prkar1α可能参与调节腭部发育融合过程。

在GWASs 中发现存在较多与颅面发育相关的潜在致病单核苷酸多态性（SNP）位点，且鉴定出的大多数变异体都位于非编码RNA 区域内［30］。lncRNA RP11-462G12.2 中的rs2262251被认为是非综合征型唇腭裂的潜在致病SNP。SNPrs2262251可影响EPMC 及唇组织中lncRNA RP11-462G12.2的结构和表达，通过荧光素酶报告发现带有rs2262251C 等位基因的 lncRNA RP11-462G12.2 可直接靶向结合IQSEC2，lncRNA RP11-462G12.2 的过表达降低了miR-744-5p 的内源表达，导致IQSEC2上调，从而促进细胞凋亡，抑制细胞增殖，表明包含rs2262251C 等位基因的lncRNA RP11-462G12.2 是一种新的miR-744-5p 海绵，可能调控IQSEC2在唇腭裂发生发展过程中的表达，这种关系可能产生一个lncRNA-miRNA基因调节轴［31］。

4.2 临床研究 Li 等［32］研究对比了唇腭裂患者与正常人外周血提取的ncRNA，结果发现两者存在明显的表达差异。Gao 等［3］在唇腭裂和腭裂患者外周血中鉴定了差异表达的ncRNAs 和mRNAs，并利用生物信息学方法探索了ncRNAs的潜在功能和关联，构建了以 lncRNA 为诱饵、miRNA 为中心、mRNA 为靶点的lncRNA-miRNA-mRNA 调控网络，结果显示，唇腭裂组与对照组相比，共有36 个lncRNAs、1 341 个 mRNAs 和 60 个 miRNAs 有表达差异；腭裂组与对照组相比有 57 个lncRNAs、1 255 个 mRNAs和162 个miRNAs 有表达差异。可能在腭裂和唇腭裂的病理中起重要作用的ncRNAs 和mRNAs 包括：miR-483-3p、miR-92b-5p、miR-4690-3p、miR-654-3p、miR-16-5p、lncRNA rP11-731F5.2、lncRNA XIST、lncRNA rP11-591c20.9 以及 RARA、SMAD2、BAG5、ZEB2 等［33］。值得注意的是，miR-92b-5p 的靶基因lncRNA XIST在腭裂组的表达明显上调，lncRNA rP11-731F5.2 与 miR-483-3p、BAG5、ZEB2间也存在较高的相关性，且lncRNA rP11-731F5.2靶基因RARA在网络中具有更多的边缘联系。由此可见，全转录组各基因相互调控、相互联系，形成了复杂的调控网络系统。上述研究表明，对于颌面部lncRNA-miRNA 的生物信息学分析可以推测大量lncRNA-miRNA 调节网络与腭裂的发生密切相关，但其潜在作用机制还待进一步验证。

5 总结与展望

近年来，lncRNA、miRNA 研究已成为基因调控领域的研究热点。通过总结腭裂中lncRNA 的作用机制及lncRNA-miRNA基因调控网络的研究进展发现，lncRNA 作为调控网络的重要参与者，因其结构复杂性和功能多样性提供了多种关于lncRNA 和miRNA 在腭裂中的调控机制，lncRNA 和 miRNA 有可能作为腭裂的早期疾病筛查、诊断和防治的潜在标志物。随着对调控网络的深入研究，将为腭裂的病因探索提供更为丰富的研究思路和更为有效的研究方法，同时为进一步研究腭裂中ncRNAs 和mRNAs的潜在调控机制奠定了基础。然而，lncRNA和miRNA的相互调控网络复杂，其在腭裂发生中的作用机制仍处于探索阶段，大多数lncRNA 与miRNA 在腭裂中的调控机制尚不明确，已知的lncRNA-miRNA-mRNA 调控网络有限，故需要更先进有效的研究技术及方法对lncRNA 的结构功能和调控机制进行系统研究，发现更多有意义的lncRNA-miRNA 调节轴，以便更深入揭示lncRNA-miRNA基因调控网络在腭裂发生发展中的作用机制，为腭裂畸形的病因研究、早期筛查及防治靶点提供新的途径。