Aβ蛋白引发阿尔兹海默症发病机制及检测方法的研究进展

刘保宏

大连大学，辽宁省大连市 116622

阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease，AD)是临床老年智力障碍中最常见的类型，是一种不可逆的神经退行性的疾病，随着老龄人口的逐年增多，其发病率也在逐年升高。AD的病因仍不明确，因此对其临床的早期诊断仍具有一定的困难。目前被大家广泛认可的β-淀粉样蛋白(Amyloidβ-proein，Aβ)级联假说认为Aβ 蛋白代谢失衡、沉积形成老年斑是诱发AD 的重要因素[1]。

Aβ是由淀粉样前体蛋白(APP)经过β和γ分泌酶的蛋白水解作用生成的含有39～43个氨基酸的多肽。当其在脑中的代谢发生失衡时，聚集和形成的低聚物和纤维体会沉积于脑中，即使少量也具有很强的神经毒性，可引起脑部病变[2]。因此针对Aβ蛋白的检测对于AD的诊断、干预、治疗有重要意义。

1 Aβ蛋白引发AD的机制

Aβ蛋白引发AD的机制主要表现为Aβ蛋白代谢失衡后引发氧化应激、神经炎症、海马区长时程增强抑制以及 Aβ降解酶活性受损等反应，以上因素均可诱导AD发病或加重病情。

1.1 Aβ蛋白引发机体氧化应激 氧化应激是由于氧化剂与抗氧化剂之间的作用不平衡，导致氧化还原信号和相关氧化分子被破坏，使脑部在氧化还原反应中更倾向于氧化[3]。然而过量的氧化应激代谢产物活性氧(ROS)将导致机体内生物大分子如脂质、蛋白质、DNA 及RNA 的过度氧化损伤[4]。同时相关研究表明，Aβ及其前体APP的N端的金属结合域中含有铜和锌等金属离子的高亲和力结合位点，铜离子能高效介导羟基自由基的氧化，因此当人体内Aβ蛋白大量异常沉积时，引起老年斑中大量的铜离子聚集参与氧化，导致AD患者脑中氧化应激反应增加，进一步加剧了脑部损伤使病情加速进展[5]。

根据研究证实大量的ROS会反作用促进Aβ蛋白的沉积[6]，且氧化应激相关氧化标记物如丙二醛(MDA)、4-羟基壬烯醛(4-HNE) 可以增强神经细胞膜上钙离子通道的开放，加速钙离子的内流，神经细胞兴奋性增强,使得蛋白激酶过度的活化，促使Tau蛋白的过度磷酸化，加重病情[7-8]。

同时近期研究表明Aβ蛋白的聚集可影响神经细胞的线粒体，从而导致线粒体的损伤[9]。过度的氧化应激不仅能阻碍线粒体电子的传递，同时会造成线粒体DNA和相关突触的损伤[10]。当线粒体损伤达到一定程度时会进一步加速相关神经细胞的凋亡，使病情恶化[11]。

1.2 Aβ蛋白刺激引发神经炎症 沉积的Aβ蛋白本身作为一种炎症刺激因子直接刺激神经细胞产生炎症因子，导致神经炎症[12]。同时Aβ蛋白能够活化老年斑周围的小胶质细胞和星形胶质细胞，引起TNFα或IL-1-β等促炎性细胞因子的释放[13]，长时间的神经炎症会导致神经突触的功能障碍加速神经元的变性，加剧脑部损伤引起病变[14]。Aβ蛋白沉积可以诱导Toll样受体4(TLR4)的活化，使神经炎症得到进一步发展[15]。同时有研究表明，小胶质细胞被诱导激活而释放多种炎症因子，其中部分因子能够降低Aβ清除效率，如胰岛素降解酶等，在炎症的基础上进一步加剧了Aβ蛋白的沉积[16]。随着炎症的发生，可溶性的Aβ蛋白会促进炎症相关的趋化因子(C-X-C基序)配体中(CXCL)8、CCL2和CCL3的水平的增加，这些配体会引发Aβ蛋白认知障碍，使得Aβ的清除障碍加剧，病情加重[17]。

1.3 Aβ蛋白对海马区长时程增强抑制 目前，有研究明确海马区长时程增强(LTP)与神经元突触的可塑性直接相关，而神经元突触的可塑性又与学习记忆能力息息相关，可以通过测定海马区长时程增强是否被抑制来反映患者学习记忆能力衰退程度[18]。经证实当Aβ蛋白沉积时，会影响作用于海马区长时程增强(LTP)效应的蛋白质从而抑制其诱导过程，减低患者的学习记忆能力[19]。当海马区的Aβ蛋白沉淀并进入CA1区时，会诱导70%神经元的丢失和锥体神经元的变形，加重海马区的长时程增强抑制，导致AD患者失忆、意识障碍等症状更严重[20]。更有相关研究证明，Aβ蛋白可以在分子和突触水平上改变海马体CA1区的G蛋白门控的内向整流钾通道(GirK)通道，抑制其诱导而降低了海马区长时程增强的效应，对AD患者的认知水平造成损害。除沉积的Aβ蛋白外，可溶性的Aβ寡聚体也可以激活NR2B基因和N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA受体)来抑制LTP。

1.4 Aβ降解酶活性受损 Aβ蛋白的沉积是由于其代谢失衡，而Aβ蛋白的降解酶的活性受损和丧失在代谢失衡中发挥着重要的作用，目前研究表明能够识别和分解Aβ蛋白单体和寡聚体的酶主要是脑啡肽酶(NEP)和胰岛素降解酶 (IDE)。NEP是一种膜结合的中性锌内肽酶，可在被激活的小胶质和星形胶质细胞中高度表达，当神经细胞激活过度或细胞损伤缺失时，则会引起NEP的分泌相对或绝对不足，造成Aβ蛋白的沉积。IDE则作为一种胞质蛋白酶发挥降解Aβ的作用，其分泌本身与年龄呈负相关，随着年龄的增加，其分泌的量降解Aβ蛋白的能力不足以和生成能力保持平衡，因而老年人中阿尔兹海默症发病更为常见。部分相关研究也表示，当人体尤其是脑中胆固醇的水平升高时，可通过消耗线粒体中的谷胱甘肽(mGSH)，来刺激氧化应激，而NEP、IDE均可作为氧化的底物被消耗导致含量减少，引起Aβ的降解障碍，导致AD发病。

2 Aβ蛋白及其相关产物的检测方法

2.1 Aβ蛋白检测 目前认为脑中的淀粉样变性已经成为AD的决定性特征，因此β-淀粉样蛋白的聚集被作为诊断的标准，并且研究表明AD患者脑中和血液中Aβ蛋白的水平与正常人比较存在显著差异。关于脑中Aβ蛋白的沉积，通常利用以11C-匹兹堡复合物B和18F为示踪剂的正电子发射体层成像(PET)来进行测定，是目前临床确诊AD和预测其转归的重要手段。近期在针对血清中可溶性Aβ低聚物的测定研究中，发现一种利用Aβ蛋白N端的表位重叠抗体捕获和检测血浆中Aβ多聚体和寡聚体的技术：多聚体检测系统(MDS)，是一个特异性较强的新型酶联免疫吸附测定法，对于辅助AD的早期诊断具有重要意义。除针对Aβ蛋白的定量测量外，Aβ蛋白二级结构的变化也是AD患者血液中重要的生物标志物，Nabers等研究表明一种基于抗体免疫的红外传感器，可观察Aβ肽二级结构的变化，且灵敏性和特异性均较好，能为AD诊断提供良好的证据。

2.2 Aβ蛋白相关基因检测 目前临床的基因研究中普遍认为，载脂蛋白E(ApoE)基因的多态性是老年痴呆典型的遗传易感因素，ApoE可从多种机制引发AD。其中ApoE4基因作用最为显著，在抑制Aβ蛋白分解的同时增加其在老年斑内的神经毒性。ApoE基因可利用PCR反应来进行多态性分析，并使用基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术(SNaPshot反应)来确定其位点的遗传变异情况。对于ApoE的基因检测可间接反映Aβ蛋白的沉积现象，使得AD的早期诊断成为可能。

IDE基因是否表达与Aβ蛋白的沉积联系十分密切， IDE的蛋白质水平与Aβ蛋白的沉淀有定量指标的作用，可利用蛋白质印迹技术(Western blot)来进行定量分析，对判断AD患者病情的严重性具有重要意义。

除此之外还有β淀粉状蛋白前体蛋白(突变APP)、早老素1(PSEN1)、早老素2(PSEN2)等显性遗传基因均会增加AD发病的风险，可利用基因测序技术来进行早期的预测，对评价AD发病风险有重大意义。

2.3 血清中神经炎性介质的检测 经研究表明与Aβ沉积密切相关的神经炎性因子有TNFα和IL-1-β，除了常规的免疫组织化学检测方法外，还可利用免疫荧光显微镜技术、共聚焦显微镜技术对该神经炎性介质进行检测。显微镜观察脑组织切片反映小胶质细胞和星形胶质细胞的损伤程度与炎性细胞因子含量成正相关，因此检测血清或脑脊液中TNFα和IL-1-β的基因表达水平对AD患者治疗和病情进展具有指导作用。根据Startin等的研究表明血清中的TNFα和IL-1-β也可用灵敏度是ELISA 1 000倍左右的超灵敏Simoa免疫测定法来进行测定，能极大程度提高细胞因子的准确性，有利于判断神经炎症的严重程度。

2.4 氧化应激相关的测定 脑脊液中Cu离子的失代偿会促进氧化应激，因此可通过测定脑脊液中Cu离子的浓度来反映氧化应激发生的程度。近年来McQuade等发明出一种Cu配合物的荧光探针技术，可与脑脊液中的Cu高特异性结合，使脑脊液中Cu离子浓度变化成像成为可能，同时也使观察Cu离子变化程度来监测脑中氧化应激的程度，来判断脑部损伤成为可能。活性氧(ROS)作为氧化应激的产物，Tang等利用与活性氧OH自由基发生反应的荧光分子探针技术对活体脑进行检测、成像分析，使得直观观察出活体脑中ROS的浓度成为可能 。Connolly等利用原代神经元培养技术复制离体且生物性状相同的脑神经元，使用四甲基罗丹明甲酯(TMRM)作为分子探针，来检测离体神经元线粒体膜电位的变化情况，膜电位变化能极好地反映出线粒体膜功能损伤的严重程度与活性氧含量的相关性。活性氧浓度的测定对于研判AD病情的严重程度具有重要价值。

3 Aβ蛋白相关检测方法仍存在的问题

3.1 取材问题 对于AD患者临床诊断，主要是依据对于脑脊液的介入性测定Aβ蛋白表型来进行确诊。虽准确率可达80%～90%，但脑脊液的采取会对患者造成创伤，对老年体质较弱患者具有相当的限制性，不适于临床推广。

3.2 检测方法问题 目前Aβ沉淀的检测多利用PET、MRI等影像学技术。据研究，成像技术对于Aβ蛋白异常积累的检测有一定的滞后性，显示结果明显慢于脑脊液(CSF)分析。同时11C-匹兹堡复合物B用作标记物其半衰期较短，导致检测过程成本高。且PET的放射性示踪剂和荧光分子探针中的放射性物质，会造成脑中的放射性同位素的暴露，造成脑部细胞不同程度的损伤。而多聚体检测系统(MDS)、超灵敏Simoa免疫测定法、抗体免疫的红外传感器等技术虽然具有较高的灵敏度和特异性，但时间成本、技术成本和技能要求也更高，因此具有相当的局限性，不适于临床的普及。同时对于ApoE基因的检测由于RT-PCT在ApoE变体的时候会导致错误的结果，可能出现一定程度的误差。

3.3 检测结果的问题 对于Aβ蛋白的PET检测由于生物标记物的类型不同、标准结果参考范围和统计方法的差距导致了检测结果依旧存在不确定性。研究表明利用ELISA方法测定血清相关的炎性介质时，由于其量少且易受机体新陈代谢、炎性细胞及分泌物的影响所以会造成测量误差较大、诊断标准不明确等问题。同时由于Aβ沉积是多基因的作用结果，单基因ApoE的测定仅能为确诊提供一定的支持条件，并不能对患者进行直接确诊。

综上所述，脑脊液相关检测存在相当的局限性，而血清中Aβ蛋白生物标志物的检测和相关基因测序在未来AD的临床检测中表现出明显优势。目前国内外已研究出很多Aβ蛋白相关生物标志物和相关基因，而明确其与AD发病率相关性的研究很少。因此明确其相关性后，研究出针对生物标记物高效、高灵敏度、廉价的检测方法对于AD早期的筛查和诊断有至关重要的作用。