植物类原球茎的研究进展

梁如意 朱文怡 朱同瑶 郭思梦 周芳美

（浙江中医药大学 医学技术学院，浙江 杭州 310053）

在对兰科植物的组织培养过程中，种子萌发时期内所形成的一种形态学组织结构称为原球茎，而外植体如茎尖、叶片等被诱导形成的与原球茎相似的脱分化组织，称为类原球茎或拟原球茎，即PLBs。一般情况下，两者均可再生出完整的植株幼苗。但类原球茎[1]由于增殖速度快、生长周期短、具有很强的根、芽分化能力和较高的抵御外部恶劣环境能力，因此可实现兰科植物的规模化生产，且其形态发育和对物质代谢的潜能与原植物相同，弥补了植物繁殖周期长、自身条件限制等缺点。对类原球茎的离体培养是现下很多植物实现快速繁殖的途径，并且对类原球茎的离体培养也一直是现下植物培养的研究热点。本文主要对近几年来影响植物类原球茎离体培养的因素及其应用的研究进展进行了综述，旨在进一步开发利用类原球茎，推动我国花卉和中药材产业的发展。

1 类原球茎的离体培养

植物离体培养技术与方法是指通过无菌操作分离植物体的一部分器官或其它组织的片段即外植体，将其接种在人工配制的培养基上，在人工控制的环境条件下进行离体培养最终获得再生植株或目的产品。目前对PLBs的离体培养的研究主要从以下几个主要角度进行展开：外植体材料的选择、培养基的筛选、植物生长调节剂的调节、天然有机物与碳源的影响、光照的影响。

1.1 外植体的选择

大量研究表明，目前能够诱导产生PLBs的植物材料有茎尖、茎段、根茎、叶片、原球茎等。茎尖是最早被广泛应用于诱导产生类原球茎的外植体材料，1960年Morel[2]在对大花蕙兰苗茎尖脱毒组培时，意外发现可由茎尖分生组织诱导形成类似某种子萌发状态的组织结构，即类原球茎，由此开启了通过类原球茎方式实现植物快速繁殖的新时代。王泽祺等[3]以石斛“火鸟”茎尖为材料，成功诱导出类原球茎并实现了其植株再生。然而虽然茎尖分化能力强、遗传稳定性高，但茎尖诱导形成类原球茎难度大。因此目前学者通常采用其它的外植体来诱导产生类原球茎。

茎段是近几年来常用于诱导产生类原球茎的外植体。焦展等[4]采取“二加二”方法研究金线莲组培苗的茎段后发现，茎段的平均诱导率最高可达88.33%。Xiu Hu等[5]在研究姜花植株再生时，发现茎部成熟节段外植体96%以上都能够诱导产生类原球茎，植株成活率高，这也是首次证明类原球茎可再生姜花，为姜花的体外繁殖提供了新的途径。然而通过茎段诱导产生类原球茎容易受到植物激素浓度等因素的影响。以铁皮石斛茎段为材料来诱导产生类原球茎时发现，受所添加的激素配比的影响，茎段更容易被诱导产生不定芽和不定根，诱导产生类原球茎的效果不佳[6]。

叶片也是常用来诱导产生类原球茎的外植体。罗剑飘等[7]以麒麟火焰兰叶片及根茎为材料发现，叶片比根茎更容易诱导产生类原球茎，以叶片作为外植体，诱导率最高能达到63%，而以根作为外植体，很难诱导产生类原球茎。因此，不同植物中所最适合用来诱导产生类原球茎的外植体并不完全相同，在通过类原球茎方式进行再生植株培育时，能否正确选择合适的外植体是直接决定实验成败的关键因素之一。

1.2 基础培养基的筛选

在植物类原球茎的培养过程中，较为常见的培养基有MS培养基、KC培养基、B5培养基、VW培养基等，为植物类原球茎的生长发育提供了所需的营养物质及无机盐，目前最常用的是MS培养基。

王泽祺等[3]在类原球茎诱导过程中，配制了不同水平MS、1/2MS和KC的基础培养基，结果显示，类原球茎诱导的最适的基础培养基为MS。樊家荣等[8]以1/2MS作为类原球茎诱导增殖的基础培养基，效果良好。Khoddamzadeh等[9]测试了1/2MS和VW培养基，根据类原球茎的存活率和增殖数量，得出1/2MS培养基的效果更好。基础培养基的选择是影响植物类原球茎的生长的重要因素之一，研究证明MS培养基具有巨大的优势。

1.3 植物生长调节剂的影响

植物生长调节剂作为植物生长发育过程中的重要调控因子，对类原球茎的快速繁殖和发育起到关键作用，目前常用的植物生长调节剂有 6-BA、NAA、IBA、2，4-D、TDZ、KT 等。TDZ 作为一种新型的植物生长调节剂，具有很强的CTK活性。TDZ在兰花的离体再生中，具有较强的抗病性、较高的增殖活性并且对器官发生的积极反应，低浓度的 TDZ有利于诱导产生 PLBs，培育再生植株，而浓度高则会抑制植株芽的伸长[10]。Bhattacharyya 等[11]在对石斛培养的研究中也验证了这一点。王泽祺等[3]通过设置不同浓度梯度的NAA，对石斛“火鸟”类原球茎进行增殖分化，结果显示一定浓度NAA会影响类原球茎的增殖质量。但有些植物使用激素组合来培养的效果更好，杨国鹏[12]发现 6-BA 和 NAA 组合对白及和蝴蝶兰类原球茎的诱导增殖效果最佳。黄霞等[13]添加TDZ和2，4-D诱导出了文心兰原球茎。因此各种植物生长调控剂的品种和数量以及不同的配比在各种植物组织培养过程中对原球茎的生长和发育效果并非完全相同，在对不同植物进行培养时，选择合适的植物激素或组合对类原球茎培养至关重要。

1.4 天然有机物的影响

在长期实践中，研究人员已经发现一些含有酶、氨基酸和微量元素的天然有机物能够促进类原球茎的生长发育，如土豆汁、椰汁、香蕉汁等，因此添加适量的天然有机物有利于植物的组织培养，在优化植物快速繁殖体系中具有极大潜力。

胡艳梅等[14]在深入探究5种天然有机物对大花蕙兰类原球茎增殖分化的影响时，以椰汁、香蕉汁等为变量，结果表明，椰子汁、香蕉汁对类原球茎的增殖分化有促进作用，其中以香蕉汁效果最好。方中明等[15]在基础培养基中添加浓度梯度香蕉汁、马铃薯汁和苹果汁，发现添加香蕉汁和苹果汁的培养基上类原球茎的增殖效果较差，添加一定浓度马铃薯汁有利于类原球茎的增殖，其中以200 g/L马铃薯汁对铁皮石斛类原球茎的增殖效果最好，而肖小军[16]的研究中得出250 g/L 土豆汁增殖效果最好。因此，添加天然有机物对类原球茎的快速繁殖有一定的积极作用，而其种类和最佳浓度还需进一步研究。

1.5 光照的影响

在调节类原球茎发生的几个因素中，黑暗条件被认为是诱导产生类原球茎的重要因素[15]。在对铁皮石斛PLBs的诱导研究汇总发现，黑暗条件下培养产生的铁皮石斛PLBs呈淡黄色，分散性良好，适宜进行类原球茎下一步的悬浮培养，然而黑暗条件对PLBs的生长存在一定的抑制作用[17]，因此目前大量研究使用12-16h光周期诱导产生PLBs。类原球茎在大量繁殖过程中可能会出现体细胞无性系变异，采用红光和远红光的结合可以有效解决这个问题[18]。光的类型可以优化类原球茎再生体系，使用红色和白色LED结合蔗糖作为碳水化合物源，或者蓝色和白色LED结合海藻糖作为碳水化合物源，对于类原球茎再生成完整植株具有最好的响应[19]。在不同的光照条件下，类原球茎中的化学成分含量有所差别。在对铁皮石斛的研究中发现，在外界光照强度≥2000lx时类原球茎生物量最高，在光照强度下培养30d后发现其多糖含量最高，而生物碱量则在500lx光照强度下培养最佳。

1.6 防褐化技术

褐化是目前植物组织培养中出现的一大难题。植物组织被切割后，在切口处的产生酚类化合物易被氧气氧化成褐色的醌类物质，植物体内酚与酚之间的平衡就被打破。并且醌类物质能够抑制植物体内的其它酶活性，当其蔓延至整个培养基后，会导致培养基发生变色甚至导致植物体死亡，所以褐化被普遍认为是植物组培过程中的三个重要问题之一[2]。

目前，在常用的防褐化物质有柠檬酸、抗坏血酸及活性炭等物质。活性炭作为一种表面吸附剂，既能够有效吸收各种不利于细胞生长发育的褐化物质，同时也会吸收培养基中的营养物质。所以采用活性炭防褐化的同时，要注意调节活性炭浓度。李艳敏[20]等人对蝴蝶兰叶片诱导产生的类原球茎进行了防褐化研究，研究发现，抗坏血酸的防褐化效果最好，柠檬酸在一定程度上也可以防褐化，活性炭处理实验组中没有观察到有类原球茎产生，猜测是因为活性炭浓度过高吸附了过多植物体生长必须的营养物质。

2 类原球茎玻璃化低温冷冻保存

目前，对于植物类原球茎的保存多采用玻璃化低温保存法。玻璃化法主要是将要保存的材料添加一定量高浓度的冷冻保护剂后投入液氮中的保存方法，材料在液氮中被快速冷冻，使组织和器官进入玻璃化状态，避免细胞和组织中出现冰晶从而造成损伤。它主要包括材料的选择、预培养、装载、玻璃化、液氮冻存、化冻与洗涤、活性检测与恢复培养等方面，其多应用于类原球茎的保存，但此方法也存在一定的弊端。

Suhana Zakaria等[21]在对沙宾石斛蓝原球茎样体（PLBs）低温保存研究中通过生化分析发现在冷冻保存时期，沙宾石斛蓝原球茎样体中叶绿素、类胡萝卜素和卟啉含量与对照相比普遍降低，PLBs再生能力有所下降，并且高浓度的低温保护剂也可能对外植体产生一定的毒性。这说明此种方法对类原球茎有一定的损伤。王春浩[22]以文心兰类原球茎为材料进行玻璃化超低温保存研究，发现在适宜的干燥预处理与处理时间条件下，类原球茎的存活率高，并且预处理在改变材料生理状态的同时也能够降低装载、玻璃化、冷冻和化冻过程给类原球茎所造成的伤害。玻璃化超低温冷冻保存作为类原球茎保存种质资源常用的方法，在兰科植物种质资源保护方面发挥着巨大作用。

3 类原球茎的应用

3.1 快速繁殖

在植物的快速繁殖中，类原球茎充当着中间繁殖体，在适宜条件下可分化培养出新的植株，实现植株再生。并且PLBs具有增殖速度快、生长周期短等优点，相较于常规的植物组织培养能够明显缩短植物的培育周期，实现规模化生产，因此已经成为部分兰科植物工业化生产的重要形式。陈常理等[23]将金线兰的茎段诱导成类原球茎实现了金线兰的快速繁殖。袁芳等[6]成功将石斛茎段诱导成类原球茎，实现了铁皮石斛的高效再生。因此，类原球茎的快速繁殖对于植物的商业化生产和濒危植物的保护有重要意义。

3.2 人工种子

人工种子是指通过组织培养技术将从植物材料中诱导出的类似于合子胚的体细胞胚或者不定芽等包埋于人工制作的具有保护功能的种皮内。在人工种皮和体细胞胚之间装载能够提供营养物质的人工胚乳，在适宜环境的条件下，人工种子可以萌发成长为完整的植株，类原球茎就是一种兰科植物组培过程中出现的类似于种子中合子胚的结构[24]。基于此原理，将类原球茎应用到植物的人工种子制作中就成为了解决植物在自然情况下繁殖率低的办法。虎头兰是一种繁殖率低且繁殖周期长的植物，付双彬等[25]证明了在适宜激素和营养物质的条件下，将类原球茎包埋制成人工种子，萌发率高达48%，并且绝大部分都可形成完整的植株。

3.3 种质资源保存

兰科植物由于具有极高药用价值与观赏价值，近年来一直饱受人们的青睐。但目前由于我国对兰科植物花卉市场缺乏规范管理，加上人为的炒作，使得野生兰科资源的破坏十分严重。为了保护兰科植物的基因多样性，迫切需要对植物种质资源的保存方法进行创新。传统的植物离体保存技术主要是对植物茎尖、种子或花粉等材料进行冷冻保存，保存工序复杂。而植物的类原球茎具有体积小、植株再生能力强、成苗容易等优点，因此可将其作为优质植物种质资源保存的一种材料。

3.4 药用次生代谢产物

近年来，药用次生植物代谢产物供不应求，但是多数药用植物人工栽培生长周期长、繁殖率低、药用次生代谢产物产量低且易受环境气候的影响，所以将类原球茎的离体培养技术应用于生产植物药用次生代谢产物具有重要意义[26]。由于类原球茎具有易分散、增殖效率高、生长周期短、分化后可得到大批量幼苗的特点，并且它们还具备与原植物相同的形态发育和物质代谢潜能，所以可以将其应用于药用次生代谢产物的生产。在铁皮石斛和金钗石斛等两种兰科植物中，类原球茎也被广泛用来提高生物活性化合物的含量，与其母株相比，从类原球茎微繁殖植物中提取的次生代谢产物如酚类、黄酮类和生物碱等的产量更高[27]。

3.5 其他应用

有研究发现，类原球茎在基因工程上也发挥着一定作用。于璇[28]以蝴蝶兰的类原球茎为供试材料，pCAMBIA1301为植物表达载体，EHA105的根癌农杆菌为菌株，通过农杆菌介导法成功构建了蝴蝶兰类原球茎转基因体系。并且近年来关于植物类原球茎的研究报道涉及类原球茎的诱导、增殖、分化、植物再生等多方面，并逐步形成一套完整的类原球茎快速繁殖体系，对于深入研究植物类原球茎，并为其一步的开发利用提供了基本条件。

4 展望

类原球茎是植物离体过程中产生的类似种子萌发的过渡形态，具有易分散、生长周期短、增殖速度快、抗逆能力较强、可实现规模化生产等优点，目前石斛类兰科植物通过类原球茎方式快速繁殖体系基本已经完善，然而对于类原球茎在独蒜兰等濒危兰科植物方面还并未见相关的研究报道，因此还需要不断对类原球茎的特点进行更深入的研究，将其应用扩大化。通过建立完整的类原球茎培养体系，不仅能够濒危植物的保护和开发利用具有促进作用，也可以进一步推动我国花卉和中药材产业的发展。此外，还能用于商业性植物的培养中，实现其工业化量产，大大节约成本和时间，具有更高的经济效益，满足其在花卉、药材等方面极大的市场需求量。