干细胞对外周神经损伤与肌肉萎缩的治疗进展

马萌萌，唐文洁,2

(1.同济大学附属东方医院干细胞转化医学产业基地,上海 200123；2.同济大学附属东方医院转化医学研究中心,上海 200120)

外周神经损伤(peripheral nerve injury,PNI)是临床上常见的创伤，可由撕裂、牵拉、切断、压迫、缺血、高温、冷冻、感染和营养代谢障碍等多种原因引起。尽管显微外科技术的发展为损伤神经的修复提供了良好基础，但由于外周神经损伤后病理过程复杂，神经再生缓慢，再生神经和周围组织粘连以及瘢痕组织的形成等，均制约着损伤神经功能的恢复。PNI通常不会威胁患者生命，但可能会引起失神经支配的肌肉发生萎缩性变化。有研究指出，在神经受损后，其支配的骨骼肌在数日内发生萎缩，随着萎缩时间延长，细胞凋亡逐渐增多，肌细胞核数量逐渐下降，最终造成骨骼肌功能永久性丧失[1]。

目前，关于PNI后神经和靶器官损伤、修复的病理机制及再生治疗方法，特别是干细胞在再生治疗中的应用研究，已取得一定进展，本文就此进行综述。

1 PNI及修复的病理机制

严重的PNI主要有两种类型，一种是外周神经受到挤压，轴突破坏，但结缔组织鞘和含有基膜管的施万细胞保持完整；另一种是外周神经受到切割后断裂，轴突、结缔组织鞘和基膜管都被打断。以上两种情况，无论轴突是受到压迫或者横断，神经元、施万细胞、巨噬细胞、细胞因子等都发生了变化。

PNI后，运动神经元与靶器官断开，神经元的形态学发生改变，例如细胞核偏心，细胞核附近开始有尼氏体溶解，并逐渐向细胞外膜延伸。损伤后神经元的一系列mRNA转录谱发生改变以适应轴突再生和神经元存活，如神经元的细胞骨架蛋白-肌动蛋白和微管蛋白上调以介导轴突的生长[2]。此外，神经营养因子、多种神经肽和细胞因子等神经元生长相关蛋白也将上调[3]。轴突断裂后，由于轴浆运输中断，轴突断端远侧很快自近端向远端发生变性、解体，即沃勒变性。在变性发生后，施万细胞不仅参与消化崩溃的髓鞘和轴索碎片，还能产生趋化因子，包括肿瘤坏死因子α、白介素-1α、白介素-1β、单核细胞趋化蛋白-1和白血病抑制因子等吸引血液里的巨噬细胞透过血-神经屏障，执行吞噬作用[4]。之后，施万细胞沿着神经内膜鞘增生形成Bungner带，为新的轴突生长提供必需的底物和支架[5]，同时通过增强细胞表面的黏附分子，如L1样细胞黏附分子和神经细胞黏附分子等的合成；分泌多种细胞外基质蛋白，包括层粘连蛋白、纤连蛋白、肌腱蛋白、硫酸肝素和胶原蛋白参与基底膜的构建；产生多种神经营养因子和受体的几种方式促进外周神经再生[6]。丝裂原激活蛋白激酶和磷脂酰肌醇-3-激酶介导的信号通路在PNI的早期也参与调节施万细胞的增殖及轴突再生[7]。另外，白血病抑制因子等细胞因子可以直接作用于神经元促进轴突再生，巨噬细胞也可分泌额外的细胞因子，促进远端神经的血管生成[8]。

尽管PNI后神经在一定程度上能够再生，但轴突的再生速度比较慢，通常为每天1mm，当肌肉重新获得神经再支配前会发生萎缩性变化，且肌肉萎缩的程度通常与神经功能的恢复密切相关。

2 PNI后肌肉萎缩和修复的病理机制

外周神经系统通过两种机制维持骨骼肌的功能：一种是神经营养因子控制，借助于运动神经元神经末梢在神经肌肉接头处释放的可溶性因子维持肌细胞的正常形态结构；一种是神经肌肉活动控制，通过神经冲动的传导引发肌膜去极化和肌电耦合维持正常的肌肉收缩[9]。PNI后，肌纤维血供障碍和肌营养因子不足可导致骨骼肌出现失营养性萎缩。另外，神经冲动的发送只能通过运动终板才能将神经递质乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)传递给骨骼肌引起收缩，且乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor,AChR)作为运动终板的主要成分在神经冲动的传递和转换中起到重要作用，所以运动终板的功能丧失和AChR的数量及分布异常可导致骨骼肌收缩障碍出现失用性萎缩。

早期失神经领域的研究表明，在退变的轴突完全丧失传导动作电位的能力之前，运动终板的结构和功能已经受损，随后发生神经肌肉传导失效，这个失效时间与轴突残端的长度有直接的关系，即轴突残端越长，神经肌肉传导失效发生的时间越晚，反之则越早[10]。一般来说，在肌肉失神经支配短期内，运动终板的形态、数量及分布无明显改变；之后运动终板退变加速，体积变小，分布不均，结缔组织增生显著直至消失，肌肉功能减退。当神经再生后重新支配效应器时，运动终板的形态开始恢复，数量增加，肌电图显示肌纤维的纤颤和正相电位逐渐减少直至消失，出现新生电位，之后逐渐转为复合电位，直到恢复为混合相和干扰相，肌肉功能逐渐正常。此外，在肌肉失神经支配后21d内，AChR数量出现代偿性增加，随着失神经支配侧的肌纤维萎缩加剧，其运动终板处AChR数量显著下降[11]，与正常神经支配的肌纤维侧紧凑且明亮的AChR相比，萎缩的肌纤维侧AChR形态分布弥散且暗淡[12]。神经再生后，运动终板区AChR数量增加，形态渐趋成熟，神经肌肉的兴奋性传导功能逐渐恢复[13]。

常见的PNI包括臂丛神经损伤和坐骨神经损伤，臂丛神经和坐骨神经作为支配上下肢的神经干，如果长时间受损导致的上下肢肌萎缩将严重影响患者的生存质量，所以早期及时地治疗尤为关键。

3 干细胞治疗PNI与肌肉萎缩的临床前研究

外周神经受损后在一定程度上可以再生，但恢复的速度非常慢。目前在创伤外科、临床和生物学研究中，依然在寻求能够加速周围神经再生和功能恢复的治疗方法。临床上PNI的显微外科修复技术包括无张力的原发性神经吻合术和自体神经移植桥接缺损[14-15]，但这些方法无法重建适当的细胞和分子微环境，导致神经功能受损的恢复不完全。同样，康复医学中的神经肌肉电刺激疗法也是如此。目前研究的一些小分子，肽类，激素，神经毒素和神经营养生长因子[16-17]可以通过减少神经元死亡，促进轴突生长来改善和加速神经修复和再生，但失神经支配的肌肉功能预后并不良好。由于干细胞能够在适当条件和特定信号下分化为成熟细胞[18]，可以修复组织损伤并改善其功能，因此，不同来源的干细胞作为外科神经修复常用的辅助疗法，有助于外周神经损伤后神经和靶器官的再生。

3.1 胚胎干细胞

胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)是早期胚胎阶段能够自我复制的全能干细胞，能有效分化成神经元和神经胶质细胞，表达髓鞘蛋白[19]。

Ziegler等[20]发现人源ESCs衍生的神经球约60%分化为施万细胞，并能包裹轴突形成髓鞘。此研究解决了施万细胞在PNI移植中遇到的一些问题，包括需要外科手术收集自体施万细胞以及培养困难和扩增数量不足的缺点。Carff等[21]将鼠源ESCs衍生的运动神经元祖细胞移植到大鼠失神经支配的骨骼肌中。移植后前7d内观察到运动神经元祖细胞存活，形成了新的神经肌肉接头，有效防止了肌肉萎缩的发生。但21d后，没有观察到移植细胞的存在，肌肉仍然发生了萎缩。Jones等[22]用人ESCs分化的神经嵴细胞与神经导管结合桥接大鼠损伤的坐骨神经，分化的神经嵴细胞能够分泌生物活性营养因子，刺激坐骨神经轴突再生，并促进了脊髓和背根神经节内几种再生相关基因的表达，不足的是评估移植细胞促进神经功能恢复的方法较少。

如何延长移植ESCs衍生细胞的存活时间，消除潜在的免疫排斥反应及解决ESCs衍生的运动神经元和骨骼肌形成稳定的神经肌肉连接等问题，将有助于长时间维持肌肉功能，为受损的轴突提供最佳的再生期，最终使肌肉获得神经再支配。由于ESCs具备体外无限增殖的特性，可能有致瘤的风险，且因其来源问题，ESCs的临床应用在安全性与伦理学上存在一定的局限性。

3.2 诱导性多能干细胞

诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)具有自我更新和多向分化的潜能，可来源于患者的皮肤成纤维细胞、血细胞及其它体细胞。因此，应用患者来源的iPSCs及衍生细胞，在临床上能提供个性化的再生治疗[18]，避免了移植排斥反应的发生。

Yokoi等[23]将iPSCs衍生的神经球加入到可吸收的神经导管中，首次修复了老年小鼠的坐骨神经损伤，有效促进了轴突再生和神经的功能恢复。iPSCs衍生的神经球约75%分化为未成熟的施万样细胞，25%分化为神经元。未成熟施万样细胞可能作为支持细胞释放某些生长因子，促使内源性施万细胞及巨噬细胞募集和清除髓鞘碎片的能力增加，髓鞘重建增强。Kimura等[24]将人iPSCs衍生的具有低亲和力神经生长因子受体阳性和胸腺细胞分化抗原-1阳性的神经嵴细胞植入到小鼠坐骨神经的6mm缺损处，促进了轴突生长、神经髓鞘形成和血管生成，运动功能也得以恢复，达到了与自体移植相似的效果，而且移植的细胞能够存活12周并迁移到了整个神经导管中均匀分布。Pepper等[25]将人iPSCs衍生的运动神经元移植到小鼠损伤侧的坐骨神经中，移植的人源细胞能够形成神经突起并沿着坐骨神经鞘远端及小腿三头肌的方向生长，生成早期神经肌肉接头，有效防止了小鼠坐骨神经损伤后肌肉萎缩的发生。不足的是对运动神经元植入部位附近进行电刺激后没有引发肌肉收缩，可能是因为人iPSCs在培养过程中产生异质细胞群，包括运动神经元前体细胞和成熟的运动神经元，而在细胞移植后存活下来的是未完全成熟的运动神经元前体细胞，因此电刺激后不会引起肌肉去极化。

总之，iPSCs的衍生细胞在促进损伤神经和肌肉恢复方面起到了重要作用，为了维持移植细胞的表型稳定性，需要考虑到细胞的体外培养和扩增可能会加剧干细胞群体的异质性。

3.3 间充质干细胞

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)来源于发育早期的中胚层和外胚层，存在于多种组织中(如骨髓、脂肪和脐带等)，属于多能干细胞，具有分化为特异细胞的能力，还可分泌生物活性因子，帮助损伤后机体构建可再生的微环境[26]，目前在临床上应用也最多。

3.3.1 骨髓间充质干细胞 骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是具备多种优点的多功能成体干细胞，在一定的诱导条件下，BMSCs能够分化为成肌细胞、神经元和神经胶质细胞等，并释放多种神经调节因子。Jia等[27]用含有BMSCs(约96%纯度)的脱细胞异种神经移植物桥接大鼠右侧坐骨神经的1cm缺损，同时联合使用粒细胞集落刺激因子，减轻了神经损伤部位的炎症反应，提高了神经调节因子的水平，协同促进了大鼠右侧损伤坐骨神经的再生和感觉、运动功能的恢复。Zheng等[28]将BMSCs分化的神经元移植到大鼠损伤的坐骨神经内，4周后发现移植的神经元仍存活并保持其形态和特征，激活并加速了去神经施万细胞的增殖，增强了神经营养因子和神经黏附分子的表达和分泌，促进了坐骨神经髓鞘形成、轴突再生和功能恢复。Guo等[29]将BMSCs静脉注射到兔体内来修复左侧臂丛神经损伤，结果发现大量的BMSCs聚集在受损神经的周围，轴突的数量和髓鞘纤维及神经纤维的密度显著提高，上肢肌肉收缩力得到很好的恢复。Chen等[30]用含有BMSCs的硅胶导管桥接大鼠右侧坐骨神经的15mm缺损，在一定程度上防止了轴突受损和肌纤维萎缩加剧，增加了髓鞘碱性蛋白和神经营养因子的产生，改善了大鼠的行走行为，对外周神经再生起到了积极作用。

3.3.2 脂肪间充质干细胞 脂肪间充质干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)在取材方面比BMSCs易获得，来源丰富且增殖速度快。除了有效分化为成骨细胞和软骨细胞外，ADMSCs也能分化为施万样细胞且分泌神经营养因子和血管生成因子[31]。Masgutov等[32]将包裹有ADMSCs的纤维蛋白胶植入到大鼠坐骨神经5mm 缺损处，不仅对感觉神经元起到了保护作用，刺激了轴突生长和髓鞘形成，更重要的是ADMSCs刺激了神经血管生成和大鼠运动功能的恢复。Schaakxs等[33]将ADMSCs分化的施万样细胞注射到大鼠失神经的肌肉中，施万样细胞能够与失神经的肌纤维融合，肌纤维的形态和功能得到改善，神经肌肉接头得以保留，萎缩的肌肉重量增加。Yang等[34]将ADMSCs分化的施万样细胞植入到大鼠脱细胞的坐骨神经中，通过神经同种异体移植联合健侧C7神经根移位术治疗大鼠的上臂丛神经损伤，发现损伤神经的轴突再生速度、再生轴突直径、髓鞘厚度和纤维密度显著增加，上臂复合肌肉动作电位，运动传导速度也明显加强。

3.3.3 脐带间充质干细胞 人类脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)取材方便，伦理争议较少，可获取的细胞数量多，增殖能力强，同时免疫原性很低，因此极其适合用于临床研究和应用，是MSCs的理想来源[35]。Zarbakhsh等[36]将接种有hUC-MSCs的硅胶管植入到大鼠坐骨神经的10mm缺损间隙中，12周后观察到了典型的神经再生，包括有髓和无髓神经纤维及新生血管。肌纤维排列紧密且纤维化程度较低，没有出现明显的肌肉萎缩。有研究指出MSCs疗法的再生潜力由旁分泌介导，细胞外囊泡为MSCs的旁分泌机制之一，hUC-MSCs产生的旁分泌效应比BMSCs和ADMSCs更强[37-38]。Ma等[39]发现通过尾静脉植入hUC-MSCs来源的细胞外囊泡能够聚集在大鼠坐骨神经5mm缺损处，下调了促炎细胞因子(IL-6、IL-1β)并上调了抗炎细胞因子(IL-10)，为神经生长提供了有利的微环境，促进轴突和施万细胞的再生及运动功能的恢复，减轻了腓肠肌的萎缩。

总之，MSCs能够促进组织再生并具有免疫调节的功能[40]。单独移植MSCs或将MSCs与神经移植物结合，以及将MSCs分化的神经元、施万样细胞等移植到损伤的神经后都可促进神经营养因子和生长因子的生成，为神经再生提供了有利的环境，对促进轴突生长和髓鞘形成发挥了重要作用。然而多数情况下尽管外周神经得以恢复，肌肉的功能恢复却不佳，可以考虑将MSCs直接注射到失神经的肌肉中来减轻萎缩的发生，增加神经肌肉功能测定的方法来评估移植细胞发挥的功效。

3.4 肌肉干细胞

肌肉干细胞(muscle stem cells)在成人体内被称为卫星细胞。正常情况下卫星细胞处于静息状态，应激条件下被激活并增殖分化为成肌细胞，最终融合为多核的肌纤维参与受损肌肉的再生和修复[41]。

Sambasivan等[42]观察到小鼠体内Pax-7表达的卫星细胞耗竭后，严重影响了自身损伤肌肉的再生。当移植了供体小鼠来源Pax-7+的卫星细胞7d后，发现有新生肌球蛋白重链表达的再生肌纤维生成。Liu等[43]发现小鼠下肢神经肌肉损伤引起的卫星细胞耗竭加剧了神经肌肉接头处的形态缺陷和肌肉萎缩，表明了卫星细胞在维持神经肌肉接头的正常功能中不可或缺。Wong等[44]将小鼠的坐骨神经横断引发左下肢肌肉萎缩，3个月后从右侧未损伤的肌肉中分离出卫星细胞移植到左侧损伤的肌肉中，通过步态分析和肌力测定来评估神经整体功能的恢复和肌肉收缩力的改善程度，但是测定结果并未提及。此外，他们还将人源卫星细胞注射到NOD/SCID-γ免疫缺陷小鼠的胫骨前肌，结果在小鼠胫骨前肌内发现有人肌营养不良蛋白表达的肌纤维生成。

总之，卫星细胞在参与失神经的肌肉再生中发挥了重要作用，对于卫星细胞在长期失神经肌肉中的数量或功能上是否真正不足，以及增强或补充卫星细胞是否可以成为任何肌肉再生的一种方法仍需要不断研究。

另外，上述干细胞治疗研究中提到的施万细胞作为周围神经系统主要的神经胶质细胞，在PNI后从高度髓化的状态转为去分化的状态，之后大量生长和增殖，为轴突生长提供了再生途径[45]。活化的施万细胞可分泌细胞因子和神经营养因子，包括胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子，直接有效地影响神经元和神经胶质细胞调节神经营养和保护作用[28]。所以对于长距离的神经缺损来说，施万细胞与神经移植物的结合修复必不可少，但是提取来源受限。而干细胞在特定的培养条件下能有效分化为表达施万细胞标志物的细胞，将它们单独或与神经导管结合移植到损伤神经处，可分泌加速轴突生长的蛋白质，提供良好的微环境以促进髓鞘的形成和神经再生。此外，施万细胞参与调节神经肌肉接头处的信号转导[32]，对肌纤维的保留和神经修复后的再支配都有效用。

4 干细胞治疗PNI和肌肉萎缩的临床研究

目前已报道的干细胞治疗PNI的临床病例较少，但也取得了较为满意的效果。例如，Grimoldi等[46]对1例上臂多发性运动和感觉神经损伤的患者进行了自体皮肤衍生的干细胞合并胶原管移植。在3年的随访期内，患者受伤的正中神经运动和感觉功能得到了持续的恢复。Braga-Silva等[47]开展的回顾性研究中提到44名前臂正中神经或尺神经受伤的患者分两组接受手术治疗。一组患者仅在神经间隙中放置硅胶管，另一组患者在硅胶管中植入自体骨髓衍生的单个核细胞，术后1年对两组患者进行评估，自体细胞移植组在运动功能、感觉能力和疼痛方面恢复的更好。Hogendoorn等[48]对9例肘关节屈伸不足的臂丛神经损伤患者进行了肱二头肌内注射自体骨髓衍生的单个核细胞和肌腱转移术治疗。细胞治疗后肌肉纤维化程度、肌纤维直径、肌纤维毛细血管比率、肌肉密度、运动单位电位和卫星细胞数量都得到很好的改善，肌肉的神经支配和再生能力增强。此外，含有骨髓干细胞的自体骨髓抽吸浓缩液结合脱细胞神经同种异体移植物修复并改善外周神经功能的Ⅰ期临床评估(NCT03964129)和自体脂肪来源的间充质细胞在外周神经重建患者中的安全性和有效性评估(NCT04346680)正在开展中，研究结果尚未报道。总体来看，已有的治疗PNI和肌肉萎缩的干细胞种类少，临床研究规模小，参与受试者人数少，存在着研究的局限性。

5 展 望

综上所述，慢性长期的骨骼肌失神经支配会产生永久性的不良影响，即使神经再生，其造成的骨骼肌功能依旧无法完全恢复。为了防治失神经性肌肉萎缩，应尽早恢复神经的连续性。目前，干细胞移植对PNI的修复机制仍不完全清楚，主要包括在适当微环境下分化为神经相关细胞，通过旁分泌效应调节神经营养活性，产生为轴突生长提供适宜环境的营养因子和细胞外基质蛋白，刺激内源性细胞增殖分化和血管生成，调节免疫反应，减少损伤组织的炎症，增强轴突再生及促进髓鞘形成。对于失神经所致的肌肉萎缩，除了及时修复神经外，还应重点利用干细胞对肌肉本身进行治疗，恢复其原有的组织形态和生理功能。目前干细胞移植治疗外周神经和肌肉损伤大多处于临床前阶段，并且临床研究也大多存在着受试者少等局限性，接下来应积极开展干细胞多中心临床研究，以确定干细胞临床治疗的安全性和有效性。总而言之，PNI后的最佳治疗策略是维持持久的神经元活力，增强轴突再生，促进神经肌肉接头的功能性神经支配并减少肌肉萎缩。面对临床上各种严重的PNI，通过单一的治疗方法取得良好的预后往往比较困难，为了获得更好的效果，需要将干细胞治疗与药理学，组织工程学和新型外科手术相结合，重点不只是增强轴突再生，也需要将施万细胞和失神经支配的肌肉中引发的病变作为研究目标，最终显著促进外周神经和肌肉功能的修复和再生，提高临床患者的生活质量。