糖尿病性视网膜病变患者血清microRNA-20a-5p、VEGF水平变化及其临床意义*

王涛，崔月玲，王晓聪，谭薇

（遵义市第一人民医院 眼科，贵州 遵义563000）

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）是一种以血糖升高为主要表现的代谢性疾病，糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）为其常见严重并发症，是患者视力下降、失明的重要原因，严重影响患者生活质量[1]。DR 是一个复杂病理过程，与长期血糖控制不佳、炎症反应、新生血管形成、细胞纤维化等有关[2]。抗血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）治疗是目前DR 主要治疗手段之一[3]。MicroRNA 是一类非编码RNA 分子，广泛参与细胞增殖、迁移、凋亡等生物学过程，还可影响VEGF 信号转导，与眼底疾病发生有密切关系[4-5]。MicroRNA-20a-5p （miR-20a-5p）为microRNA-17-92 基因簇一员，参与调控细胞增殖、凋亡，血管新生形成等病理生理过程[6-7]。有研究报道，妊娠期糖尿病患者血清miR-20a-5p 水平明显降低[8]；miR-20a-5p 能负向调控VEGF 抑制高氧诱导视网膜病变的血管新生[9]。本研究旨在分析DR 患者血清miR-20a-5p、VEGF 水平变化，探讨miR-20a-5p 参与DR 发生、发展的机制，以期为DR防治提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月—2020年12月遵义市第一人民医院眼科收治的82 例DR 患者为DR 组。其中，男性38 例，女性44 例；年龄39～74 岁，平均（64.15±11.06）岁。纳入标准：①符合《中国2 型糖尿病防治指南（2017年版）》[10]诊断标准；②符合《我国糖尿病视网膜病变临床诊疗指南（2014年）》[11]DR 诊断标准；③临床资料完整；④入院前未接受抗DR 治疗；⑤患者及家属均知情。排除标准：①合并视神经疾病、视网膜静脉阻塞、青光眼、白内障等其他眼部疾病；②合并血管瘤；③先天性弱视；④急慢性感染性疾病；⑤严重肝肾功能障碍；⑥合并其他慢性疾病；⑦合并甲状腺功能亢进、皮质醇增多症等影响糖代谢疾病；⑧有近期手术史。选取同期52 例单纯T2DM 患者为T2DM 组。其中，男性23 例，女性29 例；年龄40～75 岁，平均（64.15±12.26）岁；符合《中国2 型糖尿病防治指南（2017年版）》[10]诊断标准。选取同期42 例健康体检者为对照组。其中，男性20 例，女性22 例；年龄41～78 岁，平均（65.25±11.61）岁。3 组研究对象的性别构成、年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

采集DR 患者、T2DM 患者入院时和对照组体检时空腹静脉血6 ml，3 000 r/min 离心10 min（离心半径8 cm），分离血清，取上清液，分为2 份，置于-80℃冰箱中冷冻待检。其中一份采用Trizol 试剂盒（武汉科昊佳生物科技有限公司，货号：15596-026；规格：100 ml）提取血清总RNA，TaKaRa 逆转录合成cDNA（试剂盒购自杭州海基生物技术有限公司，货号：K1622；规格：100 Rxns）。采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测，反应体系：1.0 μl cRNA，0.3 μl Taq 酶，1.0 μl 引物，0.4 μl 10 mmol dNTP，1.2 μl 25 mmol MgCl2，2.0 μl 10×PCR buffer，3.5 μl DEPC水；反应条件：95℃预变性90 s、95℃变性30 s、63℃退火30 s、72℃延伸15 s，循环40 次。miR-20a-5p 引物：正向5'-ATGCTAAAGTGC TTATAGT-3'，反向5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT TC-3'；以U6为内参，引物：正向5'-CGCTTCGGCA GCAGCACATATAC-3'，反向5'-AATTTGCGTGTCAT CCTTGC-3'。采 用2-ΔΔCt法计算血清miR-20a-5p mRNA 相对表达量。另一份采用酶联免疫吸附试验（ELISA）（试剂盒购自上海西格生物科技有限公司，货号：XG-E102939）检测血清VEGF 水平，葡萄糖氧化酶法检测空腹血糖（FBG）水平，胶乳凝集反应法检测糖化血红蛋白（HbA1c）水平。

1.3 DR病情评估

DR 患者入院后行眼底检查，根据DR 发展阶段和严重程度[11]分为增殖型（proliferative diabetic retinopathy, PDR）27 例（PDR 组）和非增殖型（nonproliferative diabetic retinopathy, NPDR）55 例（NPDR 组）。

1.4 统计学方法

数据处理采用SPSS 26.0 统计软件，计数资料以构成比或率（%）表示，比较用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）或中位数（下四分位数，上四分位数）[M（P25，P75）]表示，比较用t检验、方差分析或H检验，进一步两两比较用SNK-q检验或χ2检验；相关分析用Pearson 法；影响因素的分析用多因素Logistic 回归分析模型；绘制ROC 曲线；P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组糖尿病病程及FBG、HbA1c水平比较

3 组糖尿病病程及FBG、HbA1c 比较，差异有统计学意义（P<0.05）；进一步两两比较，DR 组糖尿病病程长于T2DM 组，DR 组FBG、HbA1c 水平高于T2DM 组（P<0.05），T2DM 组FBG、HbA1c 水平高于对照组（P<0.05）。见表1。

表1 3组糖尿病病程及FBG、HbA1c水平比较

2.2 3 组血清miR-20a-5p mRNA 相对表达量、VEGF水平比较

3 组血清miR-20a-5p mRNA 相对表达量、VEGF 水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）；进一步两两比较，DR 组血清miR-20a-5p mRNA 相对表达量低于T2DM 组和对照组（P<0.05），VEGF 水平高于T2DM 组和对照组（P<0.05）；T2DM 组血清miR-20a-5p mRNA 相对表达量低于对照组（P<0.05），血清VEGF 水平高于对照组（P<0.05）。见表2。

表2 3组血清miR-20a-5p mRNA相对表达量、VEGF水平比较 （±s）

表2 3组血清miR-20a-5p mRNA相对表达量、VEGF水平比较 （±s）

注：①与对照组比较，P<0.05；②与T2DM组比较，P<0.05。

组别DR组T2DM组对照组F 值P 值n 82 52 42 miR-20a-5p mRNA 0.43±0.06①②0.81±0.19①0.98±0.25 182.102 0.000 VEGF/（pg/ml）194.12±56.85①②102.26±20.952①65.13±19.07 158.222 0.000

2.3 不同程度DR 患者血清miR-20a-5p mRNA相对表达量及FBG、HbA1c、VEGF水平比较

PDR 组和NPDR 组患者血清miR-20a-5p mRNA相对表达量及FBG、HbA1c、VEGF 水平比较，差异有统计学意义（P<0.05），PDR 组血清miR-20a-5p mRNA 相对表达量低于NPDR 组，FBG、HbA1c、VEGF 水平高于NPDR 组。见表3。

表3 不同程度DR患者血清miR-20a-5p mRNA相对表达量及FBG、HbA1c、VEGF水平比较 （±s）

表3 不同程度DR患者血清miR-20a-5p mRNA相对表达量及FBG、HbA1c、VEGF水平比较 （±s）

组别PDR组NPDR组t 值P 值n 27 55 miR-20a-5p mRNA 0.39±0.06 0.45±0.05-5.045 0.000 FBG/（mmol/L）12.15±3.84 9.83±2.95 3.016 0.003 HbA1c/%11.03±1.69 9.50±1.20 4.712 0.000 VEGF/（pg/ml）223.97±64.79 179.47±46.51 3.564 0.001

2.4 DR 患者血清miR-20a-5p 与FBG、HbA1c、VEGF的相关性

Pearson 法分析显示，DR 患者血清miR-20a-5p mRNA 相对表达量与FBG、HbA1c、VEGF 呈负相关（r=-0611、-0.799 和-0.545，均P=0.000）。

2.5 DR影响因素的多因素Logistic回归分析结果

以DR 发生（是=1，否=0）为因变量，糖尿病病程、FBG、HbA1c、miR-20a-5p、VEGF 为自变量，纳入多因素Logistic 回归模型，结果显示，血清miR-20a-5p 高水 平[=0.254（95% CI：0.154，0.596）]为DR 发生的独立保护因素（P<0.05），糖尿病病程长[=2.042（95%CI：1.422，2.933）]、血清HbA1c 高水平[=2.307（95% CI：1.101，4.833）]、血清VEGF 高水平[=2.570（95% CI：1.584，4.144）]为DR 发生的独立危险因素（P<0.05）。见表4。

表4 DR影响因素的多因素Logistic回归分析参数

2.6 血清miR-20a-5p、VEGF 对DR 发生的预测价值

血清miR-20a-5p 预测DR 发生的AUC 为0.816（95% CI：0.739，0.877），截断值为0.56，敏感性为97.56%（95% CI：0.915，0.997），特 异 性 为61.54%（95% CI：0.471，0.748）；血清VEGF 的AUC 为0.818（95%CI：0.742，0.879），截断值为138.25 pg/ml，敏感性为57.32%（95% CI：0.447，0.683），特异性为96.15%（95% CI：0.868，0.995）；联 合 预 测AUC 为0.892（95% CI：0.827，0.939），敏感性为91.46%（95% CI：0.832，0.965），特 异 性 为76.92%（95% CI：0.632，0.875）。见图1。

图1 血清miR-20a-5p、VEGF预测DR发生的ROC曲线

3 讨论

DR 是一种严重微血管并发症，T2DM 患者长期血糖控制不佳，血糖渗入眼部基底膜，引起眼局部组织缺血缺氧、炎症反应等，导致视网膜血管内皮细胞异常增殖和纤维化，形成病理性新生血管，破裂出血后表现为眼底出血，患者视力模糊，随着血管破裂，疤痕组织生长又可牵拉视网膜，导致视网膜脱落，最终丧失视力[3，11]。流行病学显示，我国糖尿病病程5年和10～15年患者的DR 发生率为9.7%和80.0%，已成为严重公共卫生问题[1]，因此早期发现和阐明其发病机制对DR 防治意义重大。

MicroRNA 是一类长度约22 个核苷酸的高度保守的内源性非编码小分子单链非编码RNA，能与靶mRNA 的3'非翻译端相互作用，降解靶mRNA 或翻译抑制，参与多种生物学过程。研究报道，缺血诱导视网膜新生血管后，缺血视网膜中存在多种miRNAs 异常表达，参与血管新生等过程[12]。miR-20a-5p 位于13 号染色体，已被证实参与乳腺癌、胃癌等实体瘤增殖、迁移、入侵等过程[13-14]。miR-17-92 基因簇作为miR-20a-5p 的前体，研究报道，转染miR-17-92 基因簇能恢复小鼠内皮细胞增殖、迁移、新生血管能力[15]。PLATANIA 等[16]发现糖尿病小鼠视网膜和血清中miR-20a-5p 表达显著降低，下调miR-20a-5p 表达能引起糖尿病小鼠视网膜新生血管形成。本研究结果显示，T2DM 组血清miR-20a-5p mRNA 相对表达量低于对照组，提示miR-20a-5p 低表达与T2DM 发生有关。结果还显示，DR 组血清miR-20a-5p mRNA 相对表达量低于T2DM组，PDR 组血清miR-20a-5p mRNA 相对表达量低于NPDR 组，提示miR-20a-5p 不仅与T2DM 发生有关，还可能参与DR 发生，支持PLATANIA 等[16]的观点。内皮祖细胞功能障碍是糖尿病患者血管生成并发血管并发症的关键[17]。miR-20a-5p 能抑制高糖状态下的内皮祖细胞凋亡和自噬，调节糖尿病小鼠内皮祖细胞功能，进而抑制新生血管生成[18]。该项研究进一步佐证了本研究结果，本研究结果也显示，血清miR-20a-5p 高水平为DR 发生的保护因素，说明miR-20a-5p 对DR 可能具有抑制作用，但关于其作用机制尚不明确。

VEGF 是一种糖蛋白，能通过结合血管内皮细胞表面特异性受体和血管内皮生长因子受体，发挥增加血管通透性、促进血管生成等作用，被认为是DR 新生血管形成的主要调控因子[2]。本研究结果显示，DR 组血清VEGF 水平高于T2DM 组和对照组，T2DM 组血清VEGF 水平高于对照组，PDR 组血清miR-20a-5p mRNA 相对表达量低于NPDR 组，符合既往研究报道[19]。血糖紊乱是DR 发生主要因素之一[2]。本研究结果显示，DR 组FBG、HbA1c 高于T2DM 组，PDR 组FBG、HbA1c 高于NPDR 组，符合DR 患者血糖水平变化。本研究结果还显示，DR 患者血清miR-20a-5p mRNA 相对表达量与FBG、HbA1c、VEGF 呈负相关，提示miR-20a-5p 可能通过影响血糖和VEGF 水平参与DR 发生过程。高氧诱导的小鼠视网膜病变模型中，上调视网膜组织中miR-20a-5p 表达能通过抑制VEGF 减少小鼠视网膜血管新生[9]。体外DR 模型中，高浓度糖显著降低了视网膜光受体中miR-20a-5p 表达，增加了VEGF 表达，转染miR-20a-5p 至视网膜光受体，可显著降低VEGF 表达，并抑制视网膜新生血管生成潜能[20]。上述研究表明，miR-20a-5p 可能通过负向调控VEGF 发挥对DR 的保护作用。DR 严重影响T2DM 患者生存质量，玻璃体切割和视网膜激光光凝治疗虽然能改善PDR 的视功能，但并不能解决根本问题，因此早期发现DR 十分必要[21]。本研究ROC 曲线显示，miR-20a-5p 可作为预测T2DM 患者DR 发生的指标，且联合VEGF 后预测价值更高。

综上所述，DR 患者血清miR-20a-5p mRNA 相对表达量降低，与FBG、HbA1c、VEGF 密切相关，miR-20a-5p 可能通过调控糖代谢和VEGF 介导DR的发生、发展，可作为DR 的预测指标。但关于miR-20a-5p 参与DR 的确切机制，还需更多实验证实。