MicroRNA-181a、SIRT1水平与新生儿急性呼吸窘迫综合征严重程度及预后的相关性*

林勇，束国防，陈名霞，孙晓玄，陆爱珍

（1.东南大学附属中大医院江北院区 儿科，江苏 南京210044；2.东南大学附属中大医院检验科，江苏 南京210003；3.东南大学附属中大医院江北院区 检验科，江苏 南京210044；4.复旦大学附属儿科医院 呼吸科，上海201102）

急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）是肺部或全身性损害因素引起广泛急性炎症性肺损伤导致的肺力学异常和气体交换障碍，为新生儿重症监护室（neonatal intensive care unit, NICU）常见危重症[1]。尽管产前皮质类固醇、表面活性剂、高级呼吸护理等方式极大改善新生儿ARDS 的预后，但ARDS 仍然是新生儿死亡的重要原因之一，因此早期评估患儿预后意义重大[2]。炎症反应失控是ARDS 发生、发展的重要病理生理机制之一[3]。MicroRNA 是一种非编码小分子RNA，参与了多种细胞因子转录调控，能通过影响靶基因表达调控炎症通路，在炎症反应进展中扮演重要角色[4]。有研究报道[5]，脂多糖诱导的急性肺损伤中microRNA-181a（miR-181a）能通过调节核因子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）信号通路参与急性肺损伤过程中的过度失控性炎症反应。沉默信息调节因子2 相关酶1（silent information regulator factor 2-related enzyme 1, SIRT1）为Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，SIRT1 表达下调能通过激活核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3 促进急性肺损伤的炎症反应。目前尚无研究报道miR-181a 和SIRT1 与ARDS新生儿病情严重程度和预后的关系。本研究分析ARDS 新生儿血清miR-181a、SIRT1 水平变化，探讨两者与病情严重程度及预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年10月—2021年7月东南大学附属中大医院江北院区收治的162 例ARDS 患儿为ARDS组。其中，男性92 例，女性70 例；日龄1～7 d，平均（4.18±1.08）d；体重1 200～4 000 g，平均（3 000.82±253.15） g；致病原因：脓毒症17 例、早产48 例、肺炎40 例、胎粪吸入39 例、其他原因18 例。纳入标准：①符合《“新生儿急性呼吸窘迫综合征”蒙特勒标准（2017年版）》[6]诊断标准；②明确或可疑临床损伤后出现的急性发作≤7 d；③患儿家属或监护人知情同意。排除标准：①先天性畸形、新生儿暂时性呼吸增快症引起的呼吸困难；②肺腺瘤样畸形、膈疝、表面活性物质相关的遗传性缺陷；③羊水吸入综合征；④脑性过度换气；⑤严重肝肾功能障碍；⑥临床资料不全。另选取同期64 名健康新生儿为对照组，其中，男性36 例，女性28 例；日龄1～7 d，平均（4.26±1.21）d；体重2 500～4 000 g，平均（3 048.18±246.58）g。两组性别、日龄、体重比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 血清miR-181a mRNA相对表达量、SIRT1和炎症因子水平检测

分别于ARDS 组入NICU 后24 h 内、对照组次日清晨采集股静脉血3 ml，3 000 r/min 离心10 min（半径8 cm），取上清液，分为2 份，置于-80℃冰箱中冷冻保存待检。一份血清标本用于实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR），Trizol 法提取总RNA，紫外分光光度计验证纯度，OD260/OD280 为1.8～2.0，qRT-PCR 扩增。miR-181a 引物：正向5'-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3'， 反向5'-UCACCGACAGCGUUGAAUGUUUU-3'；内参U6引物：正向5'-AGCATGCTAGCTAGCGTGAATGA-3'，反向5'-GTAGCGCTAGATGCATGCCATCA-3'。反应体系（共10.0 μl）：5.0 μl SYBR Premix Ex Taq，0.2 μl正向引物，0.2 μl 反向引物，0.2μl ROX Reference Dye，1.0 μl cDNA 模板，3.4 μl RNase-free ddH2O。反应条件：95℃预变性90 s（1 个循环）、95℃变性30 s、63℃退火30 s、72℃延伸15 s，40 个循环。反应结束后得到各反应管Ct，2-ΔΔCt法计算血清miR-181a mRNA 相对表达量。另一份用于酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清SIRT1、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平。试剂盒均购自武汉菲恩生物科技有限公司，所有操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3 病情和预后评估

ARDS 组入NICU 后24 h 内，于首次机械通气时计算氧合指数（OI），OI=平均气道压×动脉血氧分压/吸入氧浓度×100。参考《“新生儿急性呼吸窘迫综合征”蒙特勒标准（2017年版）》[6]进行病情严重程度评估，分为重度组49 例（OI ≥16）、中度组53 例（氧指数8≤OI < 16）、轻度组60 例（4 ≤OI<8）。根据患儿痊愈出院或病情危重放弃、转院、死亡分为预后不良组68 例和预后良好组94 例。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 27.0 统计软件，计数资料以构成比（%）表示，比较做χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）或中位数和四分位数[M（P25，P75）]表示，比较做t检验或Z检验或H检验；H检验的两两比较做Bonferroni 校正检验；相关性分析用Pearson 或Spearman 法；绘 制ROC 曲 线。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR-181a mRNA 相对表达量、SIRT1和炎症因子水平比较

两组血清miR-181a mRNA 相对表达量、SIRT1、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比较，差异有统计学意义（P<0.05），ARDS 组血清miR-181a mRNA相对表达量、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平高于对照组，SIRT1 水平低于对照组。见表1。

表1 两组血清miR-181a mRNA相对表达量、SIRT1和炎症因子水平的比较

2.2 不同病情严重程度ARDS患儿血清miR-181a mRNA相对表达量、SIRT1和炎症因子水平比较

轻度组、中度组、重度组患儿血清miR-181a mRNA 相对表达量、SIRT1、IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）。进一步两两比较，重度组和中度组患儿血清miR-181a mRNA相对表达量、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平高于轻度组，且重度组血清miR-181a mRNA 相对表达量、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平高于中度组（P<0.05）；重度组和中度组患儿血清SIRT1 水平低于轻度组，且重度组血清SIRT1 水平低于中度组（P<0.05），见表2。

表2 不同病情严重程度ARDS患儿血清miR-181a mRNA相对表达量、SIRT1和炎症因子水平比较 M（P25，P75）

2.3 ARDS 患儿血清miR-181a mRNA 相对表达量、SIRT1与氧指数、炎症因子的相关性

ARDS 组患儿OI 为4～22 [11.00（6.00，17.00）]。相关性分析显示，ARDS 患儿血清miR-181a mRNA相对表达量与SIRT1 呈负相关（rs=-0.788，P=0.000），与OI、IL-1β、IL-6、TNF-α 呈正相关（rs=0.780、0.833、0.776 和0.804，均P=0.000）；SIRT1与OI、IL-1β、IL-6、TNF-α呈负相关（rs/r=-0.836、-0.716、-0.691 和-0.754，均P=0.000）。见表3。

表3 ARDS患儿血清miR-181a mRNA相对表达量、SIRT1与OI、炎症因子的相关性

2.4 预后不良组与预后良好组血清miR-181a mRNA相对表达量、SIRT1水平比较

两组血清miR-181a mRNA 相对表达量、SIRT1水平比较，差异有统计学意义（P<0.05），预后不良组血清miR-181a mRNA 相对表达量高于预后良好组，SIRT1 水平低于预后良好组。见表4。

表4 预后不良组与预后良好组血清miR-181a mRNA相对表达量、SIRT1水平比较 M（P25，P75）

2.5 血清miR-181a、SIRT1 单独及联合对ARDS患儿预后不良的评估价值

ROC曲线结果显示，miR-181a评估ARDS患儿预后不良的最佳截断值为1.59，AUC 为0.777（95% CI：0.705，0.839），敏感性为80.88%（95% CI：0.717，0.857），特异性为70.21%（95% CI：0.652，0.757）；SIRT1 评估ARDS 患儿预后不良的最佳截断值为0.70 ng/ml，AUC 为0.788（95% CI：0.717，0.848），敏感性为76.47%（95% CI：0.712，0.796），特异性为87.23%（95% CI：0.832，0.917）。两者联合评估ARDS患儿预后不良的AUC 为0.907（95% CI：0.851，0.947），敏感性为5.29%（95% CI：0.788，0.902），特异性为81.91%（95% CI：0.774，0.886）。见图1。

图1 血清miR-181a、SIRT1单独及联合评估ARDS患儿预后不良的ROC曲线

3 讨论

ARDS 是一个弥散性肺损伤过程，影像学上病理性改变为双侧肺组织多个肺野的肺泡不规则渗出，新生儿ARDS 是新生儿期常见危重症，具备坏死性小肠结肠炎、新生儿窒息、呛奶、胎粪吸入综合征等独特的触发因素，且新生儿还存在肺生物学、成熟度、支气管肺发育不良易感性、免疫功能低下等差异，因此新生儿ARDS 往往临床后果较儿童和成人ARDS 更严重[7]。目前儿童和成人ARDS 相关诊断标准已得到广泛认可，而新生儿ARDS 相关诊断标准仍然未形成共识，缺乏统一的预防和救治措施，病死率较高，早期评估新生儿ARDS 病情严重程度和预后对实施治疗和改善预后意义重大。炎症反应失控是ARDS 发生发展的关键环节，肺内、肺外各种致病因素引起的急性失控性炎症反应可直接侵袭肺组织引起肺水肿，导致肺泡上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞屏障的通透性增高，各种富含蛋白、炎症细胞的水肿液进入肺泡腔和肺间质，引起ARDS，过度炎症反应还可引起弥漫性肺泡毛细血管膜损伤，导致ARDS 进一步发展[8]。

miRNAs 是一类由19～24 个核苷酸组成的内源性单链非蛋白质编码RNA，通过与靶基因mRNA 的3'-非翻译区的碱基互补结合调节靶基因功能，近年研究证实，miRNAs 参与ARDS 炎症反应进展[4]。miR-181 是一个进化及保守的分子，miR-181a 为miR-181 家族成员之一，是一种炎症应激性miRNA，miR-181a 表达改变参与多种炎症相关疾病发生发展。如ABDUL-MAKSOUD 等[9]研究显示，miR-181a 在系统性红斑狼疮患者血清中表达上调，与疾病活动指数相关。如崔昭等[10]研究显示，炎症性肠病患者血清miR-181a 表达上调，与肠道菌群失调相关。上述研究提示miR-181a 在多种疾病中发挥促炎作用。本研究ARDS 组血清miR-181a mRNA 相对表达量升高，提示miR-181a 可能参与新生儿ARDS 发生；轻度组、中度组、重度组患儿血清miR-181a mRNA 相对表达量呈依次升高趋势，且与评估新生儿ARDS 病情严重程度的OI 呈正相关，说明miR-181a 参与新生儿ARDS 发生发展。IL-1β、IL-6、TNF-α 是重要的促炎细胞因子，基础研究证实其在ARDS 炎症反应中发挥重要作用[11]，本研究结果显示，ARDS 患儿血清miR-181a mRNA 相对表达量与IL-1β、IL-6、TNF-α 水平呈正相关，提示miR-181a 高表达可能通过炎症反应途径参与新生儿ARDS 进展。其机制可能与miR-181a能靶向Toll 样受体4 激活NF-κB 信号通路有关[4]。近期李渊等[12]研究也证实，抑制急性肺损伤小鼠miR-181a 表达能降低小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平和肺泡上皮细胞细胞凋亡率，逆转肺组织水肿、炎症细胞浸润、肺泡隔增厚、肺泡腔缩小等病理改变。

SIRT1 是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性酶，可通过对组蛋白和非组蛋白等转录因子进行脱乙酰作用，参与细胞衰老、基因转录、能量平衡、氧化应激、炎症反应等多种生理功能的调控[13]。SIRT1 具有重要抗炎作用，如SHI 等[14]研究报道，在术后认知功能障碍患者中SIRT1 表达下调，上调SIRT1 表达能通过Toll 样受体4/NF-κB 信号通路抑制IL-1β，IL-6，TNF-α 等炎症细胞因子表达。在慢性阻塞性肺疾病小鼠研究中[15]，上调SIRT1 表达也能通过抑制NF-κB 信号通路抑制肺部IL-6、IL-8 等炎症细胞因子表达。本研究结果显示，ARDS 组血清SIRT1 水平降低，提示SIRT1 可能参与新生儿ARDS 发生。进一步分析显示，轻度组、中度组、重度组患儿血清SIRT1 水平呈依次降低趋势，与OI 呈负相关，说明SIRT1 参与新生儿ARDS 发生发展，分析与ARDS 患儿机体内部炎症反应上调降低了SIRT1 活性有关。本研究结果还显示，ARDS患儿血清SIRT1水平与IL-1β、IL-6、TNF-α 水平呈负相关，提示SIRT1 低表达可能通过炎症反应途径参与新生儿ARDS 进展。分析与SIRT1 能调节NF-κB 转录有关，NF-κB 为炎症反应关键转录因子，需经历乙酰化和磷酸化等多种翻译后修饰才能发挥作用，而SIRT1 作为一种去乙酰化酶，其表达降低会增强NF-κB 乙酰化，促进NF-κB 转录，导致炎症反应激活及加剧[16]。在ARDS 小鼠模型中也能检测到肺组织、肺泡灌洗液SIRT1 mRNA 表达下调，通过重组SIRT1 或SIRT1 激活剂激活SIRT1 能显著抑制炎症细胞因子释放，并改善肺组织病理变化[17]。miR-181a 是目前发现几个能靶向降调节和/或维持SIRT1 低水平的miRNA 之一，RONG 等[18]研究报道，miR-181a 能靶向SIRT1抑制鹅颗粒细胞活力，诱导鹅颗粒细胞凋亡；WU等[19]研究报道，抑制miR-181a 可靶向SIRT1 抑制NF-κB 信号通路激活，减轻脓毒症诱导的炎症反应。本研究结果也显示，ARDS 患儿血清miR-181a mRNA 相对表达量与SIRT1 水平呈负相关，提示miR-181a 和SIRT1 可能共同通过炎症反应参与新生儿ARDS 发生发展。与李渊等[12]研究报道脓毒症诱导的急性肺损伤小鼠模型中miR-181a 与SIRT1 存在靶向关系符合，但关于miR-181a 是否能靶向SIRT1参与新生儿ARDS 发生发展还需研究证实。本研究结果还显示，预后不良组血清miR-181a 水平更高，SIRT1 水平更低，考虑也与miR-181a 参与ARDS 炎症反应和SIRT1 具有抑制ARDS 炎症反应有关，提示两者可能成为新生儿ARDS 预后评估指标。本研究进一步通过绘制ROC 曲线也证实，miR-181a、SIRT1 均对新生儿ARDS 预后不良具有评估价值，且二者联合AUC 达到了0.90，说明联合检测血清miR-181a、SIRT1 水平能更好评估新生儿ARDS 病情严重程度及预后，有利于指导临床制订治疗方案。

综上所述， 新生儿ARDS 血清miR-181a、SIRT1 水平与ARDS 患儿病情严重程度及预后密切相关，可作为新生儿ARDS 预后评估指标。但本研究为单中心小样本研究，未动态监测血清miR-181a、SIRT1 水平变化，还需多中心大样本研究证实。