脓肿分枝杆菌复合群对克拉霉素耐药基因的初步研究

王怡婷 郑惠文 赵冰 夏辉 王胜芬 欧喜超 周杨 宋媛媛 郑扬 赵雁林 申阿东

脓肿分枝杆菌(Mycobacteriumabscessus)是一种快速生长的对多种药物具有先天性耐药的非结核分枝杆菌，可引起80%的快生长分枝杆菌肺部感染[1]。克拉霉素是大环内酯类药物的核心药物，也是治疗脓肿分枝杆菌感染的基石，但近期发现脓肿分枝杆菌对其耐药率呈上升趋势。尽管既往已有脓肿分枝杆菌对克拉霉素的耐药机制研究[2-3]，但由于脓肿分枝杆菌存在不同的亚种、不同的基因型，其对克拉霉素的耐药机制也不尽相同[4-6]。为进一步正确指导临床选用克拉霉素，笔者对脓肿分枝杆菌复合群对克拉霉素的耐药特征进行初步分析，为有效控制其耐药提供新思路。

材料和方法

1.菌株来源：选取中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室保存的2016—2017年全国耐药监测菌株中，鉴定为脓肿分枝杆菌复合群的385株临床分离株作为研究对象。标准株ATCC 19977和CR 5701均来自中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室。质控菌株购自中国药品生物制品检定所。研究方案获得首都医科大学附属北京儿童医院医学伦理审批(2020-k-158)。

2.菌种鉴定和耐药基因分析：采用多靶位基因测序法。(1)菌种鉴定：将冻存于-80 ℃的菌株全部复苏后接种于改良罗氏培养基，培养14 d后采用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB)提取菌株DNA。根据文献合成16S rRNA[7]、rpoB[8]、转录间隔区[8]、hsp65[9]。先采用16S rRNA对菌株进行鉴定，若鉴定为脓肿分枝杆菌复合群则采用另3种靶基因进行鉴定，当3种结果均不一致时，排除该菌种诊断，当其中2种靶基因结果一致时则可确定为该菌种。(2)耐药基因检测：根据文献合成erm(41)[5,10]、rrl[10]和rrs[11]基因特异性引物，引物序列见表1。20 μl PCR扩增反应体系为：2×Taq MasterMix 10 μl,上下游引物各0.4 μl(10 μmol),1.4 μl模板液，双蒸水7.8 μl；PCR反应条件：95 ℃预变性10 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。引物的合成、扩增产物的纯化，以及基因测序均由北京擎科生物技术有限公司完成。最后将测序得到的基因序列与GenBank数据库中的序列进行比对。

表1 脓肿分枝杆菌复合群菌株耐药基因扩增引物序列

3.药物敏感性试验(简称“药敏试验”)：采用美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推荐的微孔板稀释法对克拉霉素、阿米卡星、阿奇霉素、头孢西汀、亚胺培南、美罗培南、利奈唑胺、替加环素、莫西沙星、加替沙星、米诺环素、利福布汀、妥布霉素、左氧氟沙星等14种抗结核药品进行药敏试验[12]；药品的药敏临界值参照CLSI M24-A3指南[12]标准，对该指南中没有药敏临界值的药品，按以下原则参照：左氧氟沙星和加替沙星参考莫西沙星的药敏临界值，米诺环素和利福布汀参考堪萨斯分枝杆菌的药敏临界值，阿奇霉素参考文献[13]，替加环素参考文献[14]。

具体操作如下：刮取改良罗氏(L-J)培养基上处于生长对数期的脓肿分枝杆菌复合群菌株，将菌悬液配成0.5麦氏比浊浓度后，取50 μl加入到10 ml阳离子调节肉汤培养基中，以使最终接种液浓度约为7.5×105CFU/ml，颠倒混匀。分别将不同药品加入到含有100 μl的阳离子调节肉汤培养基96孔板的第1列，倍比稀释后加入100 μl稀释后的菌液，最后1列为不含药液的阳性对照，24 h后在无药培养基孔中加入70 μl指示剂，孵育24 h后如培养基为红色，则在所有含药培养基中加入指示剂，观察3 d 时菌株的生长情况，记录该药品对脓肿分枝杆菌复合群的最低抑菌浓度(MIC)。又因脓肿分枝杆菌复合群对克拉霉素的耐药有2种类型，故对其分别观察3、7、14 d的生长情况，并将3 d时即出现耐药的菌株判定为获得性耐药，将3 d时为敏感、14 d时为耐药的菌株判定为诱导耐药菌株(菌株数=14 d时的耐药菌株-3 d时的耐药菌株)[5,10,12]。

4.统计学处理：采用SPSS 16.3软件对研究菌株的耐药情况进行描述性分析。

结 果

1.脓肿分枝杆菌复合群亚种和耐药谱：385株脓肿分枝杆菌复合群菌株中，218株为脓肿分枝杆菌[包括185株为erm(41)T28基因型和33株erm(41)C28基因型]，163株为马赛分枝杆菌，4株为博莱分枝杆菌(数据少，代表性低，不纳入分析)。且阿米卡星、克拉霉素和阿奇霉素3种药品对脓肿分枝杆菌和马赛分枝杆菌的杀菌活性最强，见表2。

表2 14种抗结核药品对脓肿分枝杆菌复合群的药物敏感性试验结果

2.脓肿分枝杆菌复合群对克拉霉素的耐药特点： 31株为克拉霉素获得性耐药，其中，11株为erm(41)T28基因型，3株为erm(41)C28基因型，17株为马赛分枝杆菌；173株为诱导耐药株，其中，171株(98.8%)为erm(41)T28基因型，2株(1.2%)为马赛分枝杆菌，见表3。

表3 脓肿分枝杆菌复合群在不同检测时间点对克拉霉素的耐药情况

3.脓肿分枝杆菌复合群对克拉霉素和阿米卡星的耐药突变特点：在31株克拉霉素获得性耐药菌株中，10株脓肿分枝杆菌[包括7株erm(41)T28基因型和3株erm(41)C28基因型]及10株马赛分枝杆菌均在rrl基因的2058/2059位点突变，最常见突变类型分别为A2058C和A2058G。13株对阿米卡星耐药的菌株中，有9株[包括5株erm(41)T28基因型，2株erm(41)C28基因型，2株马赛分枝杆菌]在rrs基因的A1408G位点发生突变，其中7株同时对克拉霉素耐药[包括3株erm(41)T28基因型，2株erm(41)C28基因型，2株马赛分枝杆菌]。具体见表4。

表4 31株克拉霉素获得性耐药的脓肿分枝杆菌复合群菌株rrl和rrs基因耐药突变情况

讨 论

脓肿分枝杆菌对克拉霉素的耐药机制包括获得性耐药和诱导性耐药，前者可与23S rRNA的rrl基因2058或2059位点突变有关，后者则与被克拉霉素诱导表达的编码红霉素核糖体甲基化酶的erm(41)基因有关。其中，有活性的erm(41)基因能催化23S rRNA的rrl基因2058或2059位点上的腺嘌呤甲基化而产生耐药[3]。马赛分枝杆菌是脓肿分枝杆菌的一个亚种，其erm(41)基因的274 bp缺失，可导致erm(41)基因失活。此外，基于erm(41)基因的第28位碱基存在多态性，其对克拉霉素可产生不同的耐药，如erm(41)T28基因型能够产生有活性的erm蛋白，可能与克拉霉素诱导性耐药有关；而erm(41)C28基因型则对克拉霉素敏感[4-6]。本研究耐药检测显示，erm(41)T28基因型的耐药率由培养3 d时的5.9%上升至培养14 d时的98.4%，而erm(41)C28基因型的耐药率则未发生变化，提示erm(41)T28基因型发生了诱导性耐药。又因erm(41)基因只与大环内酯类药物(如克拉霉素)和氨基糖苷类药物(替代药物，如阿米卡星)的耐药具有相关性，本研究仅对这两种药品的耐药性进行分析。

克拉霉素是治疗脓肿分枝杆菌的核心药品。治疗失败的主要原因是诱导性耐药的产生。在脓肿分枝杆菌复合群中，与诱导性耐药相关的erm(41)基因在不同菌种或基因型中存在明显差异[4-6]，表明erm(41)基因的正确测序，以及分析脓肿分枝杆菌复合群对克拉霉素的耐药特征，对于预测治疗结果至关重要。

通过分析脓肿分枝杆菌复合群对不同药品的药敏试验结果，笔者发现阿米卡星、克拉霉素和阿奇霉素对脓肿分枝杆菌的杀菌活性最强，并且阿米卡星的杀菌活性高于克拉霉素，这与之前研究结果一致[15]，然而，阿米卡星需要长期进行肌内注射或静脉注射，限制了其在临床中的应用，但随着阿米卡星脂质体吸入悬浮液的出现，这种情形大大改善[16]，提示阿米卡星作为治疗脓肿分枝杆菌复合群的理想替代药品将成为现实。脓肿分枝杆菌对克拉霉素的获得性耐药率为8.1%，与法国的一项研究结果(9.09%)相近[17]，但低于我国(33.95%)[13]和韩国(15.84%)[18]的报道，高于巴西报道的5.55%[19]，这可能与不同研究中分离株的来源不同或患者治疗病史差异有关。

通过分析不同亚型脓肿分枝杆菌对克拉霉素和阿米卡星的耐药特点，笔者发现erm(41)T28基因型脓肿分枝杆菌对克拉霉素的诱导性耐药率为98.8%，高于之前56.3%的报道结果[20]，推测这些分离株可能既往接触过大环内酯类药物如克拉霉素的治疗，因此，在治疗时不宜选择克拉霉素。另外，已有研究表明马赛分枝杆菌具有截短的非功能性的erm(41)基因[4]，即使延长耐药检测孵育时间也无法诱导克拉霉素耐药，而本研究中有2株马赛分枝杆菌对克拉霉素表现为诱导性耐药，其发生机制目前还不清楚，有待进一步研究。Bastian等[10]研究表明，rrl基因突变发生在erm(41)T28基因型菌株中，而本研究中erm(41)T28和erm(41)C28基因型脓肿分枝杆菌中均发生了rrl基因突变，表明rrl基因的选择突变在erm(41)T28和erm(41)C28基因型菌株中相似，推测这可能与患者治疗史有关。而7株对克拉霉素耐药的马赛分枝杆菌在rrl基因的2058/2059位点无突变，其耐药机制需要进一步研究。

综上所述，erm(41)T28基因型脓肿分枝杆菌更易诱导克拉霉素耐药。脓肿分枝杆菌和马赛分枝杆菌最常见的获得性耐药突变位点分别是A2058C和A2058G。