高剂量异烟肼、利福喷丁在健康汉族人群中的药代动力学及安全性研究

袁媛 马嘉烨 刘旭晖 夏露 刘萍 贾晓龙 卢水华

由于结核病普遍存在的诊断延迟，发病后进行药物治疗不能充分杜绝结核病的传播。为了实现消灭结核病的目标，在结核分枝杆菌潜伏感染(latent tuberculosis infection, LTBI)阶段实施药物预防可以大幅度降低结核病的发病和传播。2011年美国疾病预防控制中心(CDC)建议每周1次的异烟肼和利福喷丁的短期疗程联合治疗12周(3HP)以治疗LTBI[1]；2020年发布的LTBI治疗指南中也推荐使用高剂量短疗程的预防性治疗方案(3HP)[2]。多数已发表的文献表明，在成人及儿童中联用异烟肼与利福喷丁比单独使用异烟肼可缩短治疗时间，同时有较高的治疗完成率[3-4]。目前，我国还没有广泛开展结核病预防性治疗，原因之一是缺少国内临床证据，对药物的有效性和安全性评估不充分；截至2021年初，公开发表的数据依然极为有限。本研究以临床试验的方式评估了异烟肼、利福喷丁预防剂量在汉族人群中的药代动力学表现以及安全性，为国家制定实施政策提供基础依据。

资料和方法

一、研究设计和对象

本研究采用平行组设计，于2019年10—12月在上海市公共卫生临床中心开展生物等效性(bioequivalence, BE)研究。通过公开招募的方式入组健康受试者，经过书面知情同意，服用研究药物后留取血液标本进行药代动力学检测并记录服药后72 h内的不良事件。研究流程及知情同意书均经过上海市公共卫生临床中心伦理委员会审阅批准(2019-S028-03)。

2019年10—12月上海市公共卫生临床中心招募36名健康受试者按1∶1随机区组分为国产制剂组(T组)18名和参比制剂组(R组)18名, T组单次口服国产异烟肼、利福喷丁各900 mg，R组口服异烟肼、利福喷丁参比制剂各900 mg，每组随机一半受试者空腹服药(T1组9名，R1组9名)，另一半受试者餐后服药(T2组9名，R2组9名)。

排除标准：(1)活动性结核病患者；(2)罹患严重的心肺疾病、严重营养不良、中度以上肾功能异常，长期服用免疫抑制剂等可能对药代动力学结果产生显著影响者；(3)血常规、肝肾功能、电解质、心肌酶谱、胸部X线摄片、凝血功能筛查等存在研究者认为有意义的异常结果；(4)严重过敏性疾病和(或)过敏体质(对2种或2种以上食物过敏者)；(5)妊娠期或哺乳期妇女；(6)2周内用药史、吸毒史和饮酒史；(7)半年内重大脏器手术史；(8)3个月内献血史；(9)研究者认为可能存在依从性不良或研究药物可能危及受试者健康的情况。

活动性结核病定义与《WS 288—2017肺结核诊断》[5]一致；实验室检测结果超过20%正常参考范围，经研究者鉴定后视为有意义的异常结果；影像学异常经放射科医师判断证实后视为有意义的异常结果。

二、研究方法

(一)受试者分组方法

筛选期共75名受试者签署知情同意书，最终38名符合入组标准，但有2名没有合适的匹配，仅作为候补人员入选，最终只有36名受试者参加了研究。共匹配男性12对，女性6对，最终T1、R1、T2、R2组各有6男3女。排除的37名受试者原因包括28名体检或实验室检查异常，2名未按照流程完成检查，4名肺部影像异常，3名因个人原因未参加本研究。

1.通过性别、体质量、年龄进行匹配，每对为一区组，通过随机区组的方法，分为2组，随机产生数字，使得每一对中两人随机服用国产制剂(T组)和参比制剂(R组)。

2.按照上述配对分组序号，前6对男性和前3对女性为一组，后6对男性和后3对女性为一组，1∶1简单随机分为空腹组(标记为1)和餐后组(标记为2)。

(二)研究药物及给药方法

研究药物选用中国食品药品监督管理局批准的商业流通用于治疗结核病的异烟肼和利福喷丁口服制剂(详见利益冲突声明)，参比制剂包括利福喷丁片(PRIFTIN®, SANOFI, USA)和异烟肼片(ISONIAZID, Teva, USA)。 药物按照直接面视下督导服药的规则在规定时间集中口服异烟肼和利福喷丁各900 mg，200 ml温水送服，每次服药间隔1 min，服药后检查口腔并要求端坐观察2 h。

(三)不良事件的观察记录

不良事件严重程度分级参照“常见不良反应事件评价标准(CTCAE)4.0.3版”[6]。主要的观察内容包括服药后72 h内发生的局部或全身不良反应，以及其他任何相关或不相关的不良事件。服药后24 h内受试者集中观察记录，同时在0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 12.0, 16.0, 24.0 h询问受试者的主观感受，24～72 h受试者可自行选择离院或留院观察，72 h回访记录期间发生的不良事件并进行血液测试。

(四)药代动力学样本采集

给药前(0 h)和给药后0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 3.5、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0、 10.0、 12.0、 16.0、 24.0、 36.0、 72.0 h(共20个采血时间点)，分别采集静脉血约3 ml至含EDTA-K2抗凝剂的真空采血管中，室温轻柔颠倒混匀，2～10 ℃，转速1700 r/min，离心10 min(离心半径15 cm)分离血浆，离心后的血浆样品室温条件将分成两份，约(0.7±0.1) ml血浆加入测试管，剩余血浆加入备份管，分装完成后及时转移至-20 ℃及以下的冰箱暂时冻存，后续需及时集中转移至-80 ℃冰箱继续保存直至转运。给药前受试者上肢安放一留置针，每次采集血液样本前抽约1.0 ml血(含封管液及静脉血)弃去。测试样本将运送至样本检测实验室(经资质认定)进行血药浓度的分析。冻存管标签记录以下信息：方案编号、受试者编号、采集时间点、样品种类(测试样及备份样标示)等。

(五)血浆样本分析方法

1. 样品处理：(1)预制备样品(于2.2 ml 96孔聚丙烯板中，冰浴，黄光)：①对于混合标准曲线样品、质控样品、系统适用性样品、平衡样品(除平衡空白样品)和测试样品等，混合样品(50.0 μl)+内标工作溶液[50.0 μl，5.00 μg/ml (利福平-d4)/5.00 μg/ml (异烟肼-d4)]。②对空白样品(Double Blank)、平衡空白样品，混合空白基质(50.0 μl)+ 75%甲醇含1 mg/ml L-抗坏血酸(50.0 μl)。③对空白质控样品(QC0)，混合空白基质(50.0 μl)+内标工作溶液[50.0 μl，5.00 μg/ml (利福平-d4)/5.00 μg/ml (异烟肼-d4)]。④对定量上限不添加内标样品(ULOQ without IS)，混合ULOQ样品(50.0 μl)+75%甲醇含1 mg/ml L-抗坏血酸(50.0 μl)。(2)以上样品板振摇混匀1 min 后，向所有样品中加入400 μl的乙腈，振摇混匀约5 min。(3)分别转移50.0 μl上清液至另外两块干净的96孔聚丙烯板中。(4)对于其中一块96孔聚丙烯板，向所有样品中添加450 μl 100%纯水含10 μg/ml 的L-抗坏血酸，涡旋混匀，用于检测待测物异烟肼的浓度。对于另一块96孔聚丙烯板，向所有样品中添加450 μl 75%甲醇含10 μg/ml的L-抗坏血酸，涡旋混匀后转移100 μl至另一干净的96孔聚丙烯板中，向所有样品中加入200 μl 100%纯水含10 μg/ml 的L-抗坏血酸，涡旋混匀，用于检测待测物利福喷丁和25-脱乙酰利福喷丁的浓度。

2.仪器及条件：(1)液相及进样系统：利福喷丁及25-去乙酰利福喷丁采用的是Waters Acquity UPLC®，异烟肼采用的是岛津 LC-30AD；质谱：利福喷丁及25-去乙酰利福喷丁采用的是API5000, Applied Biosystems/AB Sciex，异烟肼采用的是API4000，Applied Biosystems/AB Sciex。(2)液相色谱条件：利福喷丁及25-去乙酰利福喷丁的液相色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18 2.1 mm×50 mm, 1.7 μm, Waters，柱温为40 ℃，自动进样器温度为4 ℃，流动相A为纯水含0.1%甲酸，流动相B为乙腈，利福喷丁保留时间约为1.22 min、25-脱乙酰利福喷丁保留时间约为0.943 min；异烟肼的液相色谱柱为AQ-C18 HP 3 μm, 2.1 mm×100 mm, GL Sciences，柱温为40 ℃，自动进样器温度为8 ℃，流动相A为100%纯水含10 mmol/L醋酸铵，流动相B为100%乙腈，异烟肼保留时间为2.15 min、异烟肼-d4为2.12 min。(3)质谱条件：利福喷丁及25-去乙酰利福喷丁的质谱模式为电喷雾离子源(ESI)，正离子模式(Positive)，多反应监测(MRM)，质谱采集时间为3.2 min；异烟肼的质谱模式为电喷雾离子源(ESI)，正离子模式(Positive)，多反应监测(MRM)，质谱采集时间为4.2 min。

三、药代动力学参数计算和统计学处理

采用Phoenix WinNonlin 8.1软件，基于血药浓度数据，按实际采样时间点以非房室模型(NCA)进行药代动力学参数计算。

结 果

一、受试者基本信息以及服药后实验室指标的变化

受试者一般资料及实验室检测结果见表1。

二、药代动力学参数

分别对健康受试者空腹和餐后服用国产制剂(T)和参比制剂(R)后进行利福喷丁、25-去乙酰利福喷丁和异烟肼的药代动力学参数分析，发现国产制剂和参比制剂的药代动力学相似。其中，健康受试者服用国产和参比制剂，餐后比空腹，利福喷丁的体内暴露量更高。服用含高热量和高脂肪餐食后，服用国产制剂与服用参比制剂的受试者相比，体内利福喷丁和25-去乙酰利福喷丁的暴露量差异均无统计学意义。而健康受试者空腹或餐后服用参比和国产制剂后，异烟肼的体内暴露量均相似。见图1～6、表2。

图1～6 健康受试者空腹和餐后服用国产(T)和参比制剂(R)后的平均血药浓度-时间曲线。图1为健康受试者空腹服用国产(T)和参比制剂(R)后利福喷丁的平均血药浓度-时间曲线；图2为健康受试者餐后服用国产(T)和参比制剂(R)后利福喷丁的平均血药浓度-时间曲线；图3 为健康受试者空腹服用国产(T)和参比制剂(R)后25-去乙酰利福喷丁的平均血药浓度-时间曲线；图4为健康受试者餐后服用国产(T)和参比制剂(R)后25-去乙酰利福喷丁的平均血药浓度-时间曲线；图5为健康受试者空腹服用国产(T)和参比制剂(R)后异烟肼的平均血药浓度-时间曲线；图6为健康受试者餐后服用国产(T)和参比制剂(R)后异烟肼的平均血药浓度-时间曲线

表2 健康受试者空腹和餐后服用国产(T)和参比制剂(R)后药代动力学参数

三、生物等效性评价

通过单双侧t检验及(1-2α%)置信区间法，得到两种制剂Cmax或AUC0～t几何均值比值的90%CI，对于非窄治疗窗的药物，此90%CI必须落在80.0%～125.0%范围内，则判断为等效性制剂。本研究中口服国产制剂和参比制剂后，Cmax几何均值比的90%CI以及AUC0～t的几何均值比的90%CI均不完全处于在等效区间范围内。按照预设的等效性标准，国产制剂和参比制剂不是生物等效性制剂。详见表3。

表3 健康受试者空腹服用国产制剂(T)和参比制剂(R)后的药代动力学参数点估计值和90%CI

续表3

四、安全性评价

未发现3～4级不良反应，发生1～2级不良反应的受试者共4名，第1名空腹服用国产制剂后2 h内出现轻度恶心，次日晚间出现低热乏力，持续数小时后消失；第2名和第3名空腹服用参比制剂后2 h内出现轻度恶心、轻度眩晕不适，分别于2.5 h和0.5 h后缓解；第4名空腹服药后第48～72 h出现轻度胃部不适，后自行消退，于回访时上报。相应的实验室指标未见有临床意义的异常变化。

讨 论

尽管国内商品化流通的异烟肼、利福喷丁制剂都通过了安全性和有效性认证，然而没有证据表明这些药物在高剂量条件下依然能与参比制剂达到生物等效性。本研究以临床试验的形式评估了高剂量异烟肼、利福喷丁在汉族人群中的药代动力学表现和短期安全性，并与参比制剂进行了生物等效性评价。结果证实,在健康受试者中，高剂量异烟肼、利福喷丁的短期安全性良好，但研究所用国产异烟肼、利福喷丁制剂与参比制剂之间没有达到生物等效性。虽然这种药代动力学差异对实际预防效果带来的影响还不明确，但值得持续研究和关注。

Sterling等[3]在3HP方案中也是予以900 mg异烟肼/利福喷丁的剂量，但是对于体质量<50 kg的受试者予以增量调整，而本试验入组的受试者体质量指数(BMI)在17～27之间，并没有女性受试者存在体质量低于50 kg的情况，故研究的给药剂量均为900 mg，由于男女性BMI标准不一，对结果可能有一定的影响，但本研究对于后期研究仍有参考价值。服用参比制剂的受试者，餐后组比空腹组体内利福喷丁和25-去乙酰利福喷丁的暴露量增加了约50%，该结果与参比制剂在欧美、亚非等受试者中的结果较一致[2,7]； Langdon等[8]在健康人和HIV感染患者中均测定了利福喷丁及25-去乙酰利福喷丁，其中健康人餐后服用利福喷丁、25-去乙酰利福喷丁Cmax分别为23.24和13.81 μg/ml，与本研究结果的26.5和12.4 μg/ml相近；以上结果提示种族差异对利福喷丁药代动力学的影响较小，或者可能是不同企业生产的利福喷丁的崩解力是有轻微差距的，未来可以做胶囊和片剂崩解力的相关试验。服用国产制剂的受试者中，餐后组比空腹组体内利福喷丁和25-去乙酰利福喷丁的暴露量分别增加21%和40%，推测可能由于利福喷丁国产制剂为胶囊剂，与参比利福喷丁片剂相比，两者受食物影响的程度不一致。

杨清銮等[9]在矽肺患者中使用了3HP方案预防肺结核，空腹服药后利福喷丁和25-去乙酰利福喷丁的Cmax分别为32.2和15.1 μg/ml，AUC0～t分别为919.6和660.1 μg·h/ml，异烟肼的Cmax为3.7 μg/ml，AUC0～t为14.1 μg·h/ml。这个研究中无论异烟肼还是利福喷丁的药代动力学都与本研究有一定的差距，部分原因可能是由于本研究是单次服药后的结果，而矽肺患者是连续服药第8周后采血测定的结果，但同时也提示异烟肼和利福喷丁的药代动力学表现在不同人群中的异质性可能比较大，因此，在未来实施大范围预防性治疗时，需要考虑人群异质性对安全性和有效性带来的挑战。

Savic等[10]预测多种剂量利福喷丁AUC0～24，其每天1次20 mg/kg剂量下，空腹与餐后AUC0～24分别为496和645 μg·h/ml，本研究中空腹及餐后AUC0～t分别为479.3和779.7 μg·h/ml。两组数据存在差异的原因可能是源于两个研究中选用的时间截点不同(前者是24 h，后者是72 h)。有研究在肺结核患者中测定不同剂量的利福喷丁的药代动力学参数，其中900 mg利福喷丁的AUC0～t为410 μg·h/ml，25-去乙酰利福喷丁AUC0～t为349 μg·h/ml[11-12]。与本研究数据479.3和283.0 μg·h/ml有差异，这个差异可能是源于肺结核患者和健康人的体内药物代谢情况差异及联合用药的影响。Dooley等[13]研究了不同剂量利福喷丁的药代动力学，服用高脂餐后的10 mg/kg利福喷丁Cmax为17.1 μg/ml，AUC0～inf为428 μg·h/ml。本研究中等剂量利福喷丁的Cmax为15.2 μg/ml，AUC0～t为479.27 μg·h/ml，产生差异的原因可能是给药方式的不同，他们的研究中连续给药14 d，而本研究是单次给药。 尽管Tam等[14]在1997年发表的研究中认为国产利福喷丁的生物利用度仅为参比制剂的74%，但这一结果未能在本研究中证实。究其原因，两个研究所用药物来源不同，联合用药情况不同，人群不同，药代动力学检测方法也不相同，因此可比性有限。

本研究中受试者服用国产制剂和参比制剂前和72 h后的实验室指标无显著差异，变异的极值也没有临床意义，考虑到两种药物在72 h后都基本完成代谢过程，利福喷丁在肝脏、胆道中药物累积弱于利福平，其他组织无明显药物累积情况，且未有研究表明该药抗生素后效应对安全性的影响，因此推测健康成年人单次服用异烟肼900 mg/利福喷丁900 mg短期是基本安全的。但这个结果不能完全推广到所有人群，如上文所述，不同人群的药代动力学差异可能比较大，不同饮食习惯、联合用药等也可能造成较大的异质性。本研究提供了高剂量异烟肼、利福喷丁的初步药代动力学证据，未来还需要大样本人群的研究以评估其用于中国人群中的安全性和有效性。

本研究是一个初步研究，有一定的局限性。首先，由于缺少既往研究做参考，样本量的计算不充分，因此结果中显示的非等效性可能与样本量有关，本研究结果还需要进一步验证。其次，空腹组受试者服药后，异烟肼吸收较迅速，如图5所示，大部分受试者在第一个采血点(0.5 h)即达峰浓度，因此由于吸收和分布相采血点数量不足，可能导致相关的药代动力学参数计算存在一定误差。再次，本研究仅评估了两种药品的药代动力学情况，不代表国内流通的所有药品，由于缺少公开资料，目前很难推测其他同类药品的药代动力学表现。最后，本研究只是初步研究，由于研究局限性，做不到长期随访，因此本文的数据仅为药物吸收方面的比较，难以得出药物长期分布和消除的差异。

综上所述，高剂量异烟肼、利福喷丁国产制剂和参比制剂在体内的吸收、分布与消除过程有一定的差异，因此市面上流通的异烟肼、利福喷丁制剂是否适用于结核病预防性治疗尚未可知。在国内大规模开展结核病药物预防之前有必要进一步评估预防制剂的有效性和安全性，制定适合中国国情的预防性治疗实施策略。

利益冲突声明本研究的实施受到江苏南京先声药业有限公司的技术支持和部分经费资助；本研究中未使用任何由江苏南京先声药业有限公司或其关联企业生产的药品；由于潜在的利益冲突，本研究中不公开披露所用国产制剂的来源，但如有研究需要，可以联系通信作者获取药品信息。这项研究得到上海市临床重点专科建设项目(shslczdzk03002)的资助，对此研究者无利益冲突。

志谢感谢束盼博士和宋忠金博士在本研究中的悉心帮助，两位在药代动力学数据分析和临床试验设计上提供了大量技术支持。