肾移植术后BK 病毒感染与人肾小管上皮细胞的相关性研究进展

2021-12-04许瀚仁王继纳杨橙许明复旦大学附属中山医院泌尿外科上海市器官移植重点实验室上海200032

实用器官移植电子杂志 2021年2期

许瀚仁，王继纳，杨橙，许明（复旦大学附属中山医院泌尿外科，上海市器官移植重点实验室，上海 200032）

BK 多瘤病毒（BK polyomavirus， BKV）是隶属于多瘤病毒科的双链DNA 病毒，在免疫力正常的人群中缺乏临床症状，潜伏在肾脏肾小管上皮细胞和尿路上皮细胞中，处于休眠期。在肾移植患者使用大剂量免疫抑制治疗后，会激活休眠期BKV 的活性，运输到人肾小管上皮细胞（human renal proximal tubular epithelial cells， HRPTEC）内大量复制，细胞损伤、脱落，产生输尿管溃疡导致基底膜的破坏，病毒进而进入肾实质和血液循环，发展成为病毒血症，进一步发展可引起输尿管狭窄和BKV 相关性肾病（BK virus associated nephropathy， BKVAN），而BKV 从潜伏再激活会造成肾小管上皮细胞和尿路上皮细胞病变，从而导致肾小管上皮脱落加快BKV 传播速度和反复感染［1］。因此，了解BKV 与肾小管上皮细胞的最新研究进展能为今后临床上BKV 感染的诊断及治疗方案的选择提供一定的参考。本文将着重探讨BKV 与HRPTEC 的感染途径机理及关键因素、HRPTEC 相关的治疗新靶点和BKV 感染HRPTEC 的临床诊断及治疗。

1 BKV 感染HRPTEC 的机制及关键因素

临床上为了治疗BKV 感染，大多时候是选择减少免疫抑制剂和使用抗病毒药物的治疗方案，但是如此的治疗方案无法有效阻止BKV 内转运到HRPTEC，病毒仍然可以感染细胞并复制，损伤脱落时感染其余的尿路上皮细胞，加重移植肾功能损伤。初次BKV 感染后，病毒仍潜伏在不同的泌尿系统部位上，特别是肾脏及尿道的上皮细胞［2］。潜伏期可能会在正常人中无症状性尿毒症，但在免疫抑制情况下，BKV 再激活从膀胱沿尿道上皮细胞上升感染，引起输尿管狭窄，进而导致BKV 在输尿管位置以上反复感染及自身复制，包含膀胱与肾脏等上下尿路途径。尿道上皮细胞中HRPTEC 作为BKV 感染的主要天然靶细胞，了解BKV 感染HRPTEC 的机制有助于研发早期抑制BKV 复制的治疗办法。

早期研究发现BKV 经小窝介导的内吞机制进入Vero 细胞（非洲绿猴肾细胞）细胞膜质膜内，Vero细胞作为靶细胞可以解释BKV 早期感染细胞其中一种过程［3］。但是HRPTEC 是整倍体细胞，而Vero 细胞作为非整倍体细胞不利于BKV 感染研究。由于HRPTEC 在自然状态下就是BKV 感染的主要靶细胞，因此用HRPTEC 作为病毒感染靶细胞能减少细胞层面的误差［4］，实验结果与临床实际情况更加贴切。

有研究发现BKV 能经小窝介导的内吞作用进入HRPTEC 细胞膜内，小窝蛋白-1（Caveolin-1，Cav-1）是小窝的标志蛋白质，经由siRNA 介导敲除CaV-1 基因表达和消耗细胞胆固醇减少小窝介导的内吞机制能够抑制BKV 感染HRPTEC［5］。

通过电镜对BKVAN 患者的肾穿刺组织进行超微结构观察发现病毒颗粒是以无被膜形式进入HRPTEC，这从形态学上支持BKV 能经网格蛋白包被小窝介导的内吞机制进入靶细胞［6］。而Sorokin 实验室的结果表明，敲除Cav-1 基因可抑制BKV 感染HRPTEC，而敲除网格蛋白基因没法抑制BKV 感染。BKV 似乎是通过小孔而不是通过网格蛋白介导的途径进入HRPTEC，此研究进一步支持小窝内吞机制是BKV 感染HRPTEC 的重要机制［4］。BKV 在附着于HRPTEC 的细胞表面后，BKV 颗粒沿细胞表面移动，并在感染后4 h 被转运至小窝之中。经由小窝介导的细胞内吞作用后，若胞内微管运动正常，BKV 能沿着微管穿过内质网（endoplasmic reticulum， ER）运输至细胞核中，内运输过程与运动蛋白的作用无关，该研究能证明BKV 是小窝介导的内吞机制后是经沿着细胞微管结构转运进靶细胞内。

有研究证明BKV 可以入侵至外泌体-细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）中，从而使BKV 颗粒可以使用替代途径进入HRPTEC，提供了BKV 发病机理的新观点。尽管在比较EV 相关颗粒和裸BKV粒子时，我们没有发现对中和抗体的敏感性降低，但该研究也提出有关基于诱导或施用中和抗体制定预防策略的重要问题［7］。

BKV 在感染后6 ～ 8 h 到达ER，绕过高尔基体（Golgi apparatus， GA）或迅速通过GA。然后BKV颗粒进入细胞核中进行病毒复制，并且在细胞破碎后子病毒被转运至其他细胞。BKV 感染HRPTEC的过程相对缓慢，感染周期至少需要24 ～ 48 h，与多瘤病毒的SV40 感染非常相似。这是第一份证明BKV 感染独特时程并提供BKV 主要自然靶点HRPTEC 中BKV 细胞内运输机制的证据的报告。每种细胞类型的病毒生命周期都非常不同，因此，使用HRPTEC 阐明BKV 感染的精确机制和动力学非常重要。

上文阐述3 种BKV 感染途径，包含无被膜形式进入细胞内、经小窝介导的内吞机制运输至细胞内和入侵胞外的外泌体经替代途径感染HRPTEC。破译这种新的释放途径可以使治疗靶标的识别能够更好的预防BKVAN 发生。

2 HRPTEC 相关的拮抗BKV 感染新靶点

肾脏中病毒感染的特征是病毒和/或细胞毒性淋巴细胞直接诱发的肾小管损伤，损伤脱落BKV 感染的HRPTEC 通过不断地复制和转染其他尿路上皮细胞，BKV 进一步扩散感染尿路上皮细胞，感染程度加重发展成BKVAN［8］。

如前文所述，已知BKV 是通过小窝介导的内吞机制和微管结构进入至细胞中，是BKV 感染HRPTEC 的关键步骤［5］，降低胆固醇的药物能够可抑制细胞膜上小窝介导的内吞机制，进而干预BKV 感染HRPTEC。在Moriyama 研究中，HRPTEC 与BKV 和普伐他汀共培养，发现BKV 感染的HRPTEC 比例与对照组相比明显下降。而普伐他汀抑制BKV 感染细胞的机制是由于普伐他汀通过抑制胆固醇的合成降低Cav-1 的水平，从而阻碍BKV 经细胞内吞机制运输至细胞内。平时用来治疗高胆固醇血症的他汀类药物在体外实验能够抑制HRPTEC 小窝介导的内吞机制，同时证实降低胆固醇能有效降低BKV 感染的风险［9］。尽管已经证实普伐他汀能降低Cav-1水平，但仍有研究显示他汀类药物抑制BKV 感染可能与降低HRPTEC 中Cav-1 的表达并干扰内在标记化BKV 颗粒来抑制BKV 的内运输［9］。

研究发现，HRPTEC 表达3 种dsRNA：Toll 样受体3（TLR3）、黑素瘤分化相关基因5（MDA5）和视黄酸诱导基因I（RIG-I），以及双链RNA 的所有传感器。而研究证明巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）或BKV 感染期间肾脏移植活检中这3 种dsRNA 传感器的表达增加。在初级肾小管上皮细胞中，dsRNA 传感器的激活诱导了促炎性TNF-α 和抗病毒IFN-β 的产生。值得注意的是，dsRNA 还增强了促凋亡蛋白的表达。然而，由于抗凋亡蛋白的表达，单独的dsRNA 并不会导致细胞死亡。dsRNA 使HRPTEC 对由抗Fas 受体激动性抗体诱导进行凋亡，这是一种清除被BKV 感染细胞的凋亡途径。这些发现表明，HRPTEC 至少需要两个信号才能进行凋亡，即使在炎性条件下也可以帮助保持肾小管的完整性。因此，病毒dsRNA 的传感器可促进HRPTEC 中的抗病毒作用、促炎和促凋亡反应，协调肾脏中BKV 感染的控制［10］。

如今已知降胆固醇药物能抑制CaV-1 相关的感染途径、BKV 的dsRNA 传感器表达有助于抗病毒作用，针对HRPTEC 抗BKV 感染新机制的研究进展将能启发治疗BKV 相关性疾病的新方法，为病毒特异性的拮抗剂奠定了基础。

3 BKV 感染HRPTEC 的临床诊断及治疗

3.1 临床诊断：对于BKV 感染肾小管上皮细胞后的病毒扩增最好用以下感染模型解释：BKV 在肾脏中开始复制，然后尿路上皮扩增和肾小管上皮细胞脱落交叉发生，在约10 周后达到动态平衡。将肾内复制减少50%无效，并且在7 周内清除病毒血症需要＞80%，但病毒尿持续超过14 周。减少＞90%的病毒血症和病毒血症分别在3 周和10 周时清除。该模型在前瞻性监测的KT 患者中进行了临床验证，支持减少80%以上的最佳干预措施［11］。

目前主流BKV 感染性和发病机制的研究焦点主要集中在HRPTEC 上，大多数研究已将其作为导致BKVAN 纤维化的主要病毒库和致病性途径的主要驱动力［5］。这些报告得出结论，在免疫抑制的肾移植患者中，肾小管上皮细胞是病毒潜伏和再激活的主要部位［1］。发现来自几项研究的证据支持以下观点：肾小管上皮细胞感染、移植肾功能丢失，肾小管坏死是与BKVAN 相关的肾纤维化的必要先决条件。

肾移植功能下降是最常见的表现时间。患者无症状，血清进行性升高肌酐［12］。间质性肾炎与BKV 感染有关很难与急性细胞排斥反应区分开。后续的纤维化改变可导致慢性同种异体肾病。有报道显示膀胱区的上行BKV 感染可导致移植肾输尿管狭窄和尿路梗阻，随后同种异体移植物阻塞。实验室检查可发现BKV 在尿中和血中的复制增加，即较高水平的BKV 也与出血性膀胱炎，可能是BKV 的最初表现肾移植受者的肾病［12］。在出现血清肌酐升高之前，BKV 尿症和BKV 血症两者均与BKVAN 有一定的相关性，但仅有部分BKV 感染患者会加重病情发展成BKVAN。其他临床表现包括尿路梗阻和出血性膀胱炎，并可能成为BKVAN 的首发表现［13］。研究证明，体外细胞实验中BKV 原发性HRPTEC 感染均未触发抗病毒反应基因也不会诱导炎症介质，因此尿液中白细胞升高和炎症因子增多的临床表现与BKV 感染的相关性有待商榷［14］。

Decoy 细胞是指细胞内含有BKV 包涵体的脱落肾小管上皮细胞在BKV 感染患者的尿液中能检测到Decoy 细胞，能证明移植肾内有病毒复制并感染肾小管上皮细胞，但仅据此还不能诊断BKVAN。尿中检出Decoy 细胞对诊断BKVAN 仅有29%的阳性预测价值［7］。然而，镜下观察Decoy 细胞不利于诊断BKV感染，人工操作容易误判，操作流程耗时长，不利于长期随访和大量样本检测。国内有研究团队长期观察BKV 感染患者的尿沉淀标本，发现免疫组化双标志物染色能明确检测出尿沉淀中出现肾小管上皮细胞来源和膀胱上皮细胞来源的Decoy 细胞，一定程度预测BKVAN 发生［15］。除了细胞学检测以外，临床检验中可经血浆和尿液中的病毒DNA 检测或病毒蛋白1（ Viral Protein-1， VP-1） mRNA 做PCR定量检测，是一种无创检测BKV 感染的诊断性方法［7］。目前诊断BKV 感染的标准为：尿BKV DNA定量＞ 107拷贝/ml 或血浆BKV DNA 定量＞104拷贝/ml ，此标准与证实BKVAN 的活检结果有明显相关性［16］。移植肾活检是BKVAN 诊断的金标准，其病理特征包括以下特点: 肾小管上皮细胞、肾小球、集合管细胞出现细胞学改变及SV40 细胞标记阳性，肾间质内纤维组织增生和肾小管萎缩［17］。BKVAN 组织学改变可能是局灶的，或仅局限于髓质，所以移植肾活检如果仅取材1 处，有近33%的临床病例可能会出现漏诊情况［18］。SV40 大T 抗原免疫组化染色有助于鉴别移植肾穿刺标本诊断为BKVAN 或是属于移植后急性排斥反应［19］。然而移植肾穿刺对于其本身也存在损伤肾脏的风险，目前提出针对细胞学和PCR 定量检测血液尿液标本针对的无创性诊断BKVAN方式有助于提升患者移植肾的存活时间［15-16］。3.2 治疗：目前BKV 感染的治疗主要目的是抑制病毒复制、增加自身免疫防御机制同时预防急性及慢性移植排斥反应发生、保护移植肾功能，多数情况下选择减量免疫抑制剂的使用。各中心具体免疫抑制剂减量的方案不尽相同，一般是停用或减量吗替麦考酚酯（mycophenolate Mofetil，MMF）用量，改用含有抗病毒作用的免疫抑制剂方案，也有调整钙调磷酸酶抑制剂（calcineurin inhibitor，CNI）的免疫抑制药用药。

研究显示，在临床相关浓度下，CI 药物中的西罗莫司（Sirolimus，SIR）能抑制BKV 复制，而他克莫司（Tacrolimus，Tac）则会反向激活BKV 复制。差异之处在于两者需要同时竞争FKBP-12 蛋白位点，FKBP-12 是一种已知与任何一种药物结合的小型宿主细胞蛋白，而SIR 通过与FKBP-12 结合和抑制mTOR 通路达到抑制HRPTEC 中BKV 的复制，Tac 与FKBP-12 结合后则是会促进mTOR 通路从而诱导BKV 的复制［20］。有研究表明SIR 和来氟米特联合用药后能降低BKV 的大T 抗原表达并减少BKV 复制。西罗莫司和来氟米特联合抑制蛋白激酶途径（PDK1、Akt、哺乳动物雷帕霉素信号转导靶点和p70S6K），可能是抑制BK 病毒激活的有效途径。由于SIR和来氟米特均具有免疫抑制活性，因此，联合用药可减少BK 发病机制，同时保持适当的免疫抑制水平［21］。而市面上常用的抗病毒药物包含西多福韦（Cidofovir， CDV）和来氟米特（Lefluno-mide，LEF）［18］，临床上能作为MMF 药物替代使用。

在抗病毒药物当中， LEF 经常用于治疗BKVAN，LEF 的活性表征影响HRPTEC 中BKV 的生命周期。LEF 可将细胞外BKV 负荷降低90%，但具有显着抑制宿主细胞的作用。尿苷类化合物的添加在很大程度上抵消了宿主细胞和抗病毒作用，这暗示非特异性嘧啶的消耗是来氟米特的主要抗BKV 感染的主要机制，证明来氟米特能抑制BKV 复制，但同时也抑制HRPTEC 的增生作用［22］。CDV 能抑制HRPTEC 细胞内BKV 基因复制的水平达到抑制HRPTEC 的BKV 复制周期，并在较小的程度上抑制病毒体的组装和释放。CMV 目前已用于临床上小病例的系列研究，研究显示 CDV 是以剂量依赖的方式抑制病毒后代的产生，在40 lg / ml 时降低90%的病毒量。BKV 与受体结合和进入细胞等早期步骤似乎并未受到CDV 药物影响，初期大T 抗原转录和表达也未受影响，但随后的HRPTEC 内BKV复制减少90%以上，晚期BKV 的mRNA 和相应的蛋白质水平也降低90%。研究结果考虑为CDV 抑制大T 抗原表达下游的BKV DNA 复制，并涉及明显的细胞毒性影响宿主细胞。在当前的治疗和药物开发中应考虑到这一项副作用［23］。

有临床研究报道静滴人免疫球蛋白（Intravenous immunoglobulin，IVIG）联合免疫抑制剂减量能有效抑制BKV 活化复制［18］。IVIG 制剂的剂量范围为从0.1 到2.0 g/kg，同时免疫抑制。的IVIG 制剂含有高滴度的BKV 有效中和抗体。尽管IVIG 不能穿透HRPTEC 细胞膜内抑制BKV 复制，但其对BKV 的中和作用和过多的间接免疫调节作用可能有助于改善BKV 感染情况［24］。国内研究也发现免疫抑制剂咪唑立宾在体外实验能有效抑制BKV 感染HRPTEC。在高药物浓度情况下仅抑制BKV 在细胞内的活性，不会出现抑制HRPTEC 增殖再生的作用，临床上有能保护正常移植肾功能和抑制BKV 感染的潜力［25］。

如今为止抗病毒治疗的疗效有限，临床上尚未有明确的有效治疗方案，并且抗病毒药物大多含有肾毒性，会损失HRPTEC 以及移植肾功能，今后BKV 感染的治疗方向针对BKV 运输至HRPTEC 的初始步骤进行干预。