眼表宏基因组研究进展△

赵福新

微生物无处不在，是自然界中分布最广、种类最多、数量最大的一类生物群体。微生物与人类的生活密切相关，在长期进化过程中，与人形成共栖关系。有些微生物对人体有益，如肠道微生物可合成人体所需的维生素K和B族维生素(B1、B2、B6、B12)、泛酸及非必需氨基酸等，能激发和增加机体免疫能力；有些微生物则会影响人体健康，如引起机体感染发炎、菌群失调而导致疾病发生。宏基因组指自然界中全部微生物基因组的总和，由Handelsman等[1]在1998 年首次提出此概念。宏基因组学是以某一样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过高通量测序分析微生物的种类多样性、代谢特征、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作及与环境之间的关系的一种微生物研究方法学。近年来，通过宏基因组研究已发现一些疾病，如难治性肠炎、2型糖尿病、动脉粥样硬化、肥胖、自闭症等肠道中关键菌群丰度及功能变化均与疾病进展相关[2]。肠道和皮肤是人体最大的微生物来源，对保持人体的健康至关重要。而眼表是否存在微生物群颇有争议，曾有研究者认为，尽管有一些微生物存在于眼表，但是这些微生物会被眨眼、眼泪抗菌物质杀死或冲走，实验中检测到的只是一过性的微生物或被杀死后留下的微生物遗传物质，眼表并不存在定植的微生物群。但最新研究表明，眼表存在核心微生物群，且与人群年龄、地理位置、种族、角膜接触镜配戴和疾病状况密切相关[3-4]。眼表核心微生物群可刺激机体产生免疫应答，抵抗病原体的侵入，是构成眼表抗炎防线的重要组成部分，眼表核心微生物比例失调会导致眼表疾病的发生。

以往对眼表微生物进行研究主要通过传统的培养方法来进行，但可以在实验室培养的微生物种类很少，占所有微生物种类的比例不到1%。因此，眼表存在的大量不可培养的微生物无法对其进行深入研究，严重阻碍了人们对眼表疾病的认识。近年来随着宏基因组学技术的发展，并在眼表疾病研究中被广泛应用[5-7]，极大地推动了眼表微生物组学的研究。目前宏基因学主要通过16S rRNA测序、鸟枪法测序来检测及分析各类微生物。16S rRNA测序主要检测细菌基因组部分保守序列，如V3、V4区，来鉴定细菌类别，由于只检测了细菌基因组部分序列，在物种分类时只能鉴定细菌且只区别到属水平，另外可以分析细菌种类的多样性及丰度等。鸟枪法测序则是对样本中的所有微生物进行了全基因组测序，能够鉴定出细菌、真菌、病毒及寄生虫等所有微生物，且能鉴定到种水平，除了分析微生物的多样性、丰度指标外，还能分析微生物的代谢谱、毒力特征等。本文将对宏基因组学在眼表疾病包括结膜炎、角膜炎、睑缘炎、角膜溃疡、干眼、睑板腺功能障碍(MGD)等的研究进展以及对这类眼表疾病的防治作用进行综述，将有助于加深对这些疾病的认识和理解。

1 结膜炎与宏基因组

2011年，Dong等[6]首次将宏基因组学用于眼部疾病研究，对4个健康人的结膜样本进行16S rRNA测序，发现健康人结膜存在12个核心细菌属：假单胞菌属(Pseudomonas)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、根瘤菌属(Bradyrhizobium)、 棒状杆菌属(Corynebacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、葡萄球菌属(Staphylococci)、水杆菌属(Aquabacterium)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、链球菌属(Streptococcus)、链型植物菌属(Streptophyta)、甲基杆菌属(Methylobacterium)，这也是首次证实眼表存在定植的核心微生物群。2020年对中国广州、温州、北京三地的86名健康人员双眼结膜样本进行宏基因测序分析发现，眼表微生物主要为细菌、真菌、病毒，优势菌群主要为痤疮丙酸杆菌属(Propionibacteriumacnes)、表皮葡萄球菌属(Staphylococcusepidermidis)。三个地区人群眼结膜菌群存在明显的地域差异，北京地区受试者结膜菌群多样性明显高于温州和广州地区受试者，北京地区的微生物菌群也与温州和广州明显不同，推测这种差异变化可能由于所在地理位置的环境菌群不同引起[7]，表明地理环境会影响当地人群的眼表菌群。配戴角膜接触镜会影响眼表菌群组成，16S rRNA测序分析表明，配戴角膜接触镜会引起结膜菌群明显改变，与非角膜接触镜配戴者相比，角膜接触镜配戴者结膜中甲基杆菌属(Methylobacterium)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)丰度均显著增加；而嗜血杆菌属(Haemophilus)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)丰度均明显降低，而且结膜的菌群组成与眼睑皮肤菌群更相似[8]，我们推测结膜的菌群可能来源于以角膜接触镜为媒介携带眼睑皮肤上的细菌。2017年，Zhang等[9]通过16S rRNA测序研究配戴软性角膜接触镜和硬性角膜接触镜对结膜菌群的影响，发现角膜接触镜配戴并没有影响菌群α多样性，只是引起一些菌群的相对丰度增加，其中，相比于正常未戴镜组，硬性角膜接触镜配戴组患者结膜中芽胞杆菌属(Bacillus)、塔特姆菌属(Tatumella)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)丰度均明显降低，而软性角膜接触镜配戴组患者结膜中代尔夫特菌属(Delftia)丰度下降，而脓毒性菌属(Elizabethkingia)丰度增加，说明配戴角膜接触镜会影响眼表菌群组成。有研究者对手术取下的翼状胬肉边缘和结膜穹隆部样本进行16S rRNA测序分析，发现翼状胬肉边缘和结膜穹隆部细菌菌群结构与成分与以前报道的结膜微生物数据相比明显不同，但α多样性并没有区别[10]。Shivaji等[4]对17名正常人双眼共34个结膜样本的真菌通过传统培养及宏基因组测序比较，发现培养法检出率只有12.5%，只有曲霉菌被检出，而宏基因组测序检出率为73.5%，总共有65个真菌属被检出，明显高于培养法。这说明宏基因组分析明显提高了微生物的检出率，有助于疾病的诊断。因此，结膜宏基因组学可用于结膜炎等的诊断、感染率分析、配戴角膜接触镜安全性监测及配戴方法的改良等。

2 角膜炎与宏基因组

角膜炎常与环境、气候、用眼卫生，特别与角膜接触镜清洁及配戴、洗手及眼镜盒消毒等相关，常见于细菌、真菌感染。早期通过传统的培养方法，已检测出铜绿假单胞菌[11]、肺炎链球菌[12]、镰刀菌和曲霉菌[12]等。2019年，Ge等[13]对真菌性角膜炎进行16S rRNA高通量测序发现，与正常对照眼比较，真菌性角膜炎患病组有较低的细菌菌群多样性，其中棒状杆菌属(Corynebacterium)和葡萄球菌属(Staphylococcus)均呈低丰度表达，而假单胞菌属(Pseudomonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、柄杆菌属(Caulobacter)和嗜冷杆菌属(Psychrobacter)丰度均较高。提示这些菌群丰度改变可能增加了真菌的感染风险。2019年，Prashanthi等[14]对真菌性角膜炎患者的结膜及角膜刮取物进行真菌核糖体小RNA内转录间隔区2区域测序分析发现，与健康者相比，真菌性角膜炎患者结膜及角膜刮取物中真菌α多样性明显降低，丰度也存在明显差异，其中子囊菌门(Ascomycota)相对丰度明显升高，而担子菌门(Basdiomycota)则降低；并且发现眼表存在11个核心真菌属，分别为曲霉属(Aspergillus)、毛球腔菌属(Setosphaeria)、马拉色霉菌属(Malassezia)、腐皮镰孢菌属(Haematonectria)、 假丝酵母菌属(Candida)、翘孢霉菌属(Emericella)、青霉菌属(Penicillium)、镰刀菌属(Fusarium)、枝孢属(Cladosporium)、内生真菌属(Choiromyces)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)。这也说明眼表除了有核心细菌菌群外[6]，还存在核心真菌菌群[14]。我们认为，眼表细菌和真菌多样性水平及丰度变化导致菌群失调是导致真菌角膜炎的主要原因。对22例外伤性角膜溃疡患者和20名正常对照者结膜样本进行高通量鸟枪法测序发现[15]，在外伤性角膜溃疡患者中，微生物以细菌为主，偶见真菌，未见病毒，相比于正常健康者，外伤性角膜溃疡患者菌群α多样性明显降低，其中荧光假单胞菌属和铜绿假单胞菌属丰度相比正常健康眼均明显增高，与炎症相关的信号通路，如细菌趋化性、鞭毛装配、生物合成、降解代谢通路均明显增强，说明外伤性角膜溃疡患者眼表微生物菌群改变与角膜溃疡有关，但由于样本较小，我们认为菌群改变是否影响外伤性角膜溃疡进展仍需更多研究和更大样本证实。综上，角膜炎主要以细菌和真菌感染为主，细菌和真菌的菌群多样性降低、感染性或机会性致病菌群丰度增加是导致真菌炎的重要原因之一。

3 干眼与宏基因组

干眼指泪液的质和(或)量的异常引起的泪膜不稳定和眼表损害，导致眼部不适症状。眼表微生物可能影响泪膜结构及稳定性，进而导致干眼发生。2007年，Graham等[16]通过对干眼受试者下结膜囊样本利用传统的细菌方法培养及对16S rRNA基因进行PCR鉴定，培养法检测到的细菌主要是凝固酶阴性葡萄球菌，而PCR法鉴定出红串红球菌属(Rhodococcuserythropolis)、产酸克雷伯菌属(Klebsiellaoxytoca)、欧文菌属(Erwiniasp)。2017年，陈红等[17]对干眼患者的结膜印迹细胞样本进行宏基因组测序分析，发现干眼患者眼表微生物α多样性与健康受试者相似，干眼患者结膜中有15 种微生物相对丰度较高，干眼患者富集的抗生素抗性基因明显多于健康受试者，推测可能与干眼患者用药有关，提示对干眼患者用药要注意耐药问题，防止引起菌群失调导致病情难以愈合。对35例干眼和54例非干眼受试者进行16S rRNA测序分析发现[18]，干眼组菌群α多样性和β多样性明显降低，其中拟杆菌和脆弱拟杆菌在干眼组明显富集，而假单胞菌主要在非干眼组富集。以上研究均提示，干眼患者眼表微生物组成结构发生改变，菌群变化是影响干眼的一个致病因素。研究结果提示，微生物在干眼中的作用复杂，需要更多和更大样本的研究来阐明微生物在干眼病程中的作用及致病机制，为干眼预防及治疗提供了一定的指导和帮助。

4 MGD与宏基因组

MGD是一种慢性、弥漫性睑板腺功能异常，以睑板腺终末导管阻塞、缺失，分泌睑脂的质和(或)量异常为特征。有研究表明，眼表微生物可分解睑板腺脂质，产生的代谢产物对睑缘产生刺激会影响MGD。2017年，OCEAN协作组会议报道[19]MGD结膜菌群以葡萄球菌属(Staphylococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)及蠕形螨属(Demodex)为主。利用传统的细菌培养方法在MGD患者眼表可培养出凝固酶阴性的葡萄球菌(主要为表皮葡萄球菌)、痤疮丙酸杆菌、棒状杆菌以及金黄色葡萄球菌[20]。还有研究表明，表皮葡萄球菌分泌的胆固醇酯酶和脂肪蜡酯酶在MGD的发病中起重要作用[21]。2016年，Watters等[22]对新西兰MGD症状轻重不一的患者的睑缘样本进行研究，发现其菌群组成比较相似，病情轻重程度似乎与菌群组成变化无关。而基于中国MGD患者的研究发现，在MGD患者中有较高的细菌检出率，并且可培养出的细菌种类要显著多于对照组[23]，提示细菌种类增多与MGD相关。对35例干眼受试者分成MGD组和非MGD组，发现两组间α和 β多样性并没有差异，在MGD组中杆菌属丰度较高，而拟杆菌属丰度较低[18]，提示MGD与某些菌群丰度变化有关。2020年，Suzuki等[24]对36位健康人的睑板腺、结膜及眼睑皮肤进行16S rRNA测序，三个部位菌群α多样性在性别上并没有差异，但青年人菌群α多样性明显高于老年人，提示年龄与MGD菌群多样性呈负相关。青年人睑板腺和结膜菌群结构相似，而老年人结膜与眼表皮肤菌群结构相似。2020年，Zhao等[25]对61例MGD患者和15位正常对照者眼睑、结膜和眼睑皮肤宏基因组进行鸟枪法测序，结果发现睑板腺的细菌丰度与结膜及眼睑皮肤细菌丰度明显不同，睑板腺微生物种类与眼睑皮肤接近，明显与结膜部分不同，提示睑板腺微生物可能来自眼睑皮肤；并且发现MGD患者的睑板腺中具有独特的微生物，如弯曲杆菌属(Campylobactercoli)、空肠弯曲菌属(Campylobacterjejuni)、粪肠球菌属(Enterococcusfaecium)，而在正常对照者睑板腺中并不存在，表明这些菌属的增加可能是引起MGD的原因之一。对宏基因组进行功能注释分析发现，MGD患者睑板腺微生物群的化学趋化能力、免疫侵袭毒力及介导Ⅳ型胶原分泌的能力均明显增强。我们认为这些微生物改变引起眼表免疫侵袭毒力增强，最终导致MGD的发生发展。因此，调节MGD患者眼表的菌群结构是预防或治疗MGD的一个好的干预手段。

5 眼表疾病与肠道菌群

有研究表明，肠道菌群可能影响眼表疾病发生，两者之间存在一定关联[26]。2009年，Oresic等[27]对无菌饲养小鼠和普通饲养小鼠的晶状体和视网膜进行脂质组学研究，相对于无菌饲养小鼠，普通饲养小鼠晶状体中磷脂酰胆碱消失，而视网膜中乙醇胺缩醛磷脂明显升高，说明肠道微生物会影响晶状体和视网膜脂质代谢。对真菌性角膜炎和健康者的肠道菌群进行分析发现[28-29]，真菌性角膜炎患者肠道中细菌的丰度和多样性明显低于健康者肠道，有益细菌数量明显下降，但两组间真菌谱没有明显变化，说明肠道细菌组成变化可能影响到真菌性角膜炎进展。肠道菌群也与葡萄膜炎有关[30]，葡萄膜炎患者肠道中抗炎性菌群(如粪杆菌属、拟杆菌属、毛螺菌属等)均明显减少，益生菌群和抗菌微生物也均显著下降[31]。另有研究发现[30]，葡萄膜炎患者肠道真菌丰度和多样性明显降低，一些病原性真菌，如马拉色霉菌属、白色念珠菌、光滑念珠菌、曲霉属真菌，在葡萄膜炎患者肠道中明显增多。也有研究发现，干眼患者肠道中粪杆菌属丰度明显降低，可能经“肠道菌群失调-眼表-泪腺轴”通路影响干眼[32]。另外，肠道微生物也可能通过“肠-视网膜轴”影响青光眼的发生发展[33]。因此，肠道菌群变化可能影响眼表感染性疾病，两者之间存在一定关联[26]。这也提示我们，在研究和治疗眼表疾病时，也要考虑肠道菌群变化对它的影响，可通过调整肠道菌群来帮助治疗眼表感染或免疫性疾病。

6 宏基因组在眼表疾病诊断和治疗中的应用

2019，Shivaji等[4]对眼表真菌经传统培养法及高通量测序结果进行比较，发现传统培养只有12.5%的检出率，只检测出1个真菌属，而高通量测序检出率则高达73.5%，可检测出65个真菌属。说明高通量测序不论从病原检出率还是菌群种类，均远高于传统的培养方法，这有助于了解疾病真实及准确的病因，并针对性地进行治疗。宏基因组学现已成为感染性角膜炎一个好的诊断学手段[34]。对角膜供体保存液进行了高通量测序，结果发现在传统诊断方法诊断为阴性的样本中发现多种细菌(如铜绿假单胞菌、链球菌等)的存在[35]，因此宏基因组学的应用有助于提高角膜移植的成功率及安全性。眼表宏基因组学研究成果还可用于抗菌性角膜接触镜研发，降低角膜接触镜配戴引起的微生物感染风险[36-37]。2017年，St Leger 等[38]发现小鼠眼结膜存在乳腺炎棒状杆菌，可以诱导T细胞产生白细胞介素17，可以抵御真菌(如白色链球菌)感染。因此，移植乳腺炎棒状杆菌到眼表是一种治疗感染性眼病的新策略。早于2009年，美国巴斯科姆帕尔默眼科研究所(Bascom Palmer Eye Institute)就启动了眼表微生物组项目(Ocular Microbiome Project)来研究眼表微生物组成、丰度等变化及在眼表疾病中的作用，极大推动了眼表宏基因组学的研究。宏基因组学在眼表感染性疾病中的应用可明显提高病原菌的检出率，有助于眼表疾病的诊断，更好地明确其病因、分析正常菌群或致病菌群及代谢谱变化特征，辅助临床医师诊断及用药，能把眼表感染性疾病的诊治提高到一个新的层次。

7 小结与展望

眼表宏基因组学的研究可通过对宏基因组测序产生序列进行功能注释，分析不同代谢通路、生物合成通路在该群体中的富集及其疾病发生中的作用，明确是否有特殊的细菌代谢产物来解释眼部症状的个体化差异。在疾病状态中，微生物群体的变化与周围相关微生物群体的关系一直是研究中的重要问题，通过对不同部位微生物的研究，判断异常增多的微生物是否更有可能源自周围已有的微生物群体。此外，也需要分析患者微生物群体变化，眼表皮肤是否也有未知的改变，以及其特征性变化与眼部不同位置菌群组成之间的关系。这些将有助于人们了解眼部的菌群变化，明确哪些是定植在眼部的有益菌群和致病微生物，从而指导临床医师在开具抗生素处方时，深入考虑药物对微生物群体的风险和益处，防止杀死对眼睛有益的微生物，保持眼部的菌群平衡。对有害微生物，可针对性地应用一些抗菌药物及滴眼液、抗菌角膜接触镜等，从而降低眼表感染性疾病发生的风险。