牙周组织低氧环境与牙周炎发生发展的研究进展

唐 宋， 张晓南

(重庆医科大学附属口腔医院·口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室·重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室，重庆 401147)

根据《第四次中国口腔健康流行病学调查报告》，我国成年人的牙周健康率仅约9.1%，且牙周炎患病率与年龄呈现明显相关性。生理情况下牙周膜血流比牙髓或脑血流稍低，其氧含量为2.9%～5.7%，且易受咬合力的影响[1]。牙周炎是低氧相关疾病之一，近年来，研究发现当牙周组织发生病变时，因局部炎性因子释放和组织代谢增强引起氧的供求失衡，以及炎症环境引起血液微循环破坏，均可导致局部牙周组织处于相对缺血、低氧状态，而深牙周袋和牙周致病菌可进一步降低牙周组织的氧张力[1-2]。本综述探讨牙周组织低氧与牙周炎发生发展的关系及炎性分子机制，为牙周炎的防治提供一定的临床借鉴。

1 低氧与缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1， HIF-1)

缺氧环境下机体可通过多种生物学变化和生化反应来提高细胞氧合及存活率[3]，包括促血管新生、改善细胞代谢以及调控细胞活性相关分子表达等。HIF是缺氧介导相关事件(包括炎症、肿瘤等)的关键调节蛋白，主要包括HIF-1、HIF-2和HIF-3，而在缺氧反应中最重要的调节蛋白是异源二聚体HIF-1，对于HIF-2及HIF-3的研究还需要更进一步地深入。

HIF-1是哺乳动物缺氧反应中最重要的响应分子之一，它是由两个亚单位组成的异二聚体： 一个α亚单位，与氧浓度呈负相关；一个β亚单位，与氧浓度无明显相关[4]。HIF-1α和HIF-1β均包含两种特殊结构： 碱性螺旋-环-螺旋结构(basic helix-loop-helix)和PAS结构域，其中这两种结构的羧基半端是HIF-1与DNA结合的位点。“缺氧应答元件”(hypoxia response element， HRE)是一类特异性的DNA序列，通过与HIF-1结合而引起HIF-1相关靶基因表达的上调[4]。常氧条件下HIF-1α被脯氨酸羟化酶迅速降解，而低氧干扰脯氨酸羟化酶介导的HIF-1α降解，导致HIF-1α稳定化，并通过两个核定位信号在低氧细胞的细胞核中积累，从而与HIF-1β形成异源二聚体，随后激活HIF-1途径，然而有研究表明HIF-1β并不是HIF-1α核内积累的必要条件[5]，因此猜测HIF-1α可独立于HIF-1β发挥功能，其机制需要进一步研究。低氧是包括炎症、肿瘤等在内很多疾病的共同特征，牙周炎是近年来发现的低氧性疾病之一，揭示低氧与牙周炎的相互关系对牙周病防治意义重大。

2 低氧对牙周细胞增殖能力的影响

牙周细胞可参与牙周组织形成再生及免疫分泌功能，对牙周组织的内环境稳定起着至关重要的作用，但在牙周炎和正畸治疗等过程中，牙周组织内环境稳态被破坏，牙周组织易发生缺氧性改变，明显影响牙周细胞的正常增殖及迁移能力。研究发现，低氧与牙周细胞增殖作用存有时间依赖性关系，且与不同氧浓度相关。在重度缺氧(1%O2)、中度缺氧(2%O2)和轻度缺氧(5%O2)条件下培养人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblast, hPLF)，发现其增殖率在初期(24 h)增加而后期(48、72 h)下降，且随氧浓度的降低其增殖抑制的现象出现越早且越明显，牙周膜细胞也有类似的表型[6-7]。但有研究称短暂缺氧(1 h、2%O2)即可出现人牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)增殖活性下降[8]。观察和培养的方式、缺氧条件的时间框架以及细胞类型的差异都可以导致这些特异性研究结果产生。在缺氧条件下，人牙周膜韧带细胞(human periodontal ligament cells, hPDLCs)与细胞呼吸代谢密切相关的蛋白组学(包括LDHA、GAPDH等)发生显著变化[6]，这些代谢变化为细胞适应性反应提供了必需的能量，可部分解释细胞增殖变化的原因。

严重炎症和组织破坏的病变往往具有较低的成纤维细胞密度和较高的炎性细胞浸润，牙周炎病变越严重，牙龈成纤维细胞的数量和功能也明显降低，且成纤维细胞增殖分化和迁移能力随着年龄的增长而下降[9-10]。体外研究表明，在低氧培养环境中牙周膜韧带细胞和成牙骨质细胞的多种细胞功能(如增殖分化和细胞因子产生等)发生改变[11]。低氧对牙周细胞增殖分化及迁移的影响是通过多种信号通路的激活而发生的，通过Wnt、Notch和Shh等信号途径，HIF-1α在调节细胞增殖、分化和多能性方面发挥重要作用[12]。低氧可能通过调节牙周细胞的增殖分化及迁移促进组织的修复再生，其机制研究是目前热点，这可能为牙周组织的新生提供新的策略。

3 低氧对牙槽骨的影响

低氧对牙槽骨的影响一方面是由于多种牙周组织细胞(如hPDLCs、HGFs等)因低氧刺激而产生促炎介质及细胞因子(IL-1β、IL-6、MMP、PGE2、NO和TNF-α等)，从而打破牙槽骨正常的代谢平衡，引起骨和胶原的代谢紊乱[13]。已有研究发现TNF-α升高后通过上调Smad泛素调节因子1(Smurf1)水平诱导骨丢失[14]，而牙周炎所致骨丢失的具体机制仍然需要深入研究。亦有研究发现，PDLCs的增殖和成骨分化因低氧而抑制[15]。更多研究表明低氧激活PDLSCs、骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)的成骨分化[7，8，16]。由于细胞活力、种类及观察培养方法的差异可能导致了低氧对牙周细胞成骨分化的影响呈现出不同的研究结果。

对低氧介导的骨代谢机制进行研究是理解牙周炎所致牙槽骨丢失机制的重要途径，研究发现多条骨代谢相关通路的激活与低氧相关。PDLSCs作为牙周组织修复再生的重要来源，低氧通过MEK/ERK和p38MAPK信号通路可促进PDLSCs成骨分化，而MAPK及ERK信号通路转导对成骨细胞分化、成骨细胞相关基因表达和MSC向成骨细胞系转化也起关键作用[7-8]，p38MAPK对缺氧的反应比ERK更迅速，这说明p38MAPK在低氧诱导的PDLSCs成骨分化中可能发挥更重要的作用。另外，通过体外低氧模拟实验发现hPDLCs中HIF-1α表达增多，随后炎性介质表达通过PI3k、p38、ERK、JNK、PKC和NF-κB途径而上调[17]，从而影响骨和胶原代谢，这与低氧下牙周细胞中促炎介质及细胞因子表达增加的趋势一致。已有研究表明低氧环境下HIF-1途径参与骨的形成和改建，而且认为HIF-1α在成骨耦合与血管新生中起着重要的调控作用[18]。动物实验发现HIF-1α基因敲除小鼠的骨小梁体积和骨形成率明显降低，其皮质骨也发生结构改变，成骨细胞分化实验中发现成骨细胞分化潜能被过表达HIF-1α活性形式所抑制[19-20]；Hirai等发现HIF-1的激活可下调NF-κB、促炎/骨吸收因子等，抑制炎症性骨丢失的上游基因表达水平[21]。这些结果说明HIF-1α在牙周组织低氧环境下对骨代谢的重要调控作用，且随着HIF-1α水平的改变其生理功能也会发生相应变化，而其机制有待进一步研究。另外，NF-κB通路是炎症中骨吸收和破骨细胞产生的重要通路，且NF-κB是破骨细胞活性和促炎细胞因子产生的核心转录因子，研究发现低氧可影响细胞中NF-κB和骨保护素的表达水平，进一步促进牙周炎的进展[22-23]。许多研究证明低氧在牙周组织的细胞活力和骨重塑中的关键作用，但低氧是否促进骨形成或骨吸收仍然存在争议。我们认为低氧初期对牙槽骨的影响以促进作用为主，而后期以吸收作用为主。牙周炎相关骨吸收与低氧应激存在密切关系，这为牙周炎导致的骨吸收提供了新的机制，同时为预防和治疗牙槽骨丢失提供新的方向。

4 低氧对人牙周细胞凋亡和自噬的影响

细胞凋亡(apoptosis)是基因控制的细胞程序性死亡，Bnip3基因被认为是缺氧状态下的初级促死亡基因(primary pro-death gene)，能在低氧环境下诱导表达。自噬(autophagy)是一种“自食”的胞内机制，整个自噬过程主要受雷帕霉素靶蛋白复合物1和Beclin1复合体调节，LC3蛋白是目前常用的自噬标记蛋白[24]。研究发现HIF-1α依赖性途径和HIF-1α非依赖性途径是低氧诱导自噬发生的两条主要途径，已证明缺氧条件下hPDLCs的自噬和凋亡与HIF-1α的激活明显相关[1，25]。HIF-1通路的激活是抑制间充质干细胞凋亡的有效保护途径，低氧时凋亡抑制因子核仁蛋白3(apoptosis repressor nucleolar protein 3, NOL3)表达增加[26-27]，而自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值因低氧刺激升高，提示低氧环境对细胞凋亡起到一定的抑制作用，且在缺氧反应中发挥关键作用的是细胞自噬。低氧培养环境中常发生成骨细胞及hPDLCs中线粒体肿胀和粗面内质网扩张，不仅导致线粒体功能失调，还诱导线粒体的自噬作用和细胞凋亡活性，通过抑制线粒体的自噬作用可降低因低氧所诱导的凋亡活性[28]，这可能是导致细胞能量代谢和蛋白合成改变的重要原因，但其具体机制还需深入研究。研究根尖周病变时发现自噬相关蛋白、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、HIF-1α和BNIP3的表达均增加[25]，提示低氧可通过调控相关蛋白表达介导自噬。

另外，在低氧环境下泛素相关酶和热休克蛋白的表达参与自噬和凋亡。研究发现泛素结合酶E2、泛素相关蛋白1和泛素样蛋白5等可靶向蛋白酶体降解的底物[29]，这可能对低氧诱导的细胞自噬起到一定的促进作用。HSPA8作为伴侣介导的自噬中一个重要组成部分，可通过它将蛋白质导入溶酶体，还能与HSPβ1和HSPA5等蛋白广泛作用，协同发挥抗hPDLCs凋亡作用[30]，亦有研究发现HSP60也参与了牙周炎进展和牙齿发育[31]。凋亡和自噬通常是细胞对刺激的适应性反应，关于牙周炎所致低氧引起的牙周细胞凋亡和自噬机制还需要进一步研究，以求从一方面揭示牙周炎的发病机制。

5 低氧对牙周组织血管的影响

慢性炎症引起牙周组织发生微循环障碍、低灌注，从而导致牙周组织低氧微环境形成。低氧能调节血管张力，被认为是血管生成的有利刺激，已证明血管生成与低氧联系紧密[32]，其中VEGF和HIF-1在该过程中发挥核心调控作用。低氧环境下HIF-1的激活和聚集可导致VEGF的转录激活，从而引导内皮细胞迁移到低氧环境中，促进血管新生以增加高氧血液向缺氧组织的输送，VEGF作为血管生成的主要标志物，也是HIF-1α主要的下游靶基因[33]。有研究发现PI3K/Akt通路是VEGF调控的关键信号级联，COX2/PGE2/VEGF信号通路可能参与了缺氧条件下内皮细胞的迁移和旁分泌[8，34]。在低氧炎症微环境下，活性HIF-1的不断产生和核聚集还引发其下游基因的广泛转录，参与血管生成及舒缩调节、细胞生长及凋亡、屏障及离子转运功能，HIF-1α也被认为在成血管与成骨的耦合关系中起着重要的调节作用[18]。与健康牙龈相比，牙周炎组织中VEGF和HIF-1α的表达有明显增加[35]，进一步说明VEGF和HIF-1α在牙周炎组织血管再生中起关键作用。研究还发现HIF-1α和HIF-2α在组织血管调控方面具有互补作用： HIF-1α促进血管生长，HIF-2α促进血管成熟[36-37]。另外，牙周致病菌来源的肽聚糖导致牙周组织细胞TLR2激活，而炎症环境下TLR2激活可显著增强HIF-1α和BMP-2的表达，从而上调其下游成骨和血管生成相关基因的表达，以促进牙槽骨骨血管生成和组织血管化[16]，这些研究结果提示牙周致病菌对牙周血管生成发挥间接作用。

研究表明，VEGF表达上调和血管新生在炎症、伤口愈合和骨重塑中发挥重要的作用[38]。炎症牙周组织的血管新生被认为是牙周组织低氧下的适应性表现。低氧培养原代人脐静脉内皮细胞时发现，细胞早期增殖情况与常氧组相似，但延长缺氧后其增殖活性与前面提及的PDLCs具有相似的表型[39]。这些研究提示低氧对血管形成并非单一的促进作用，而是在培养条件发生改变的情况下，其对机体的生理功能影响亦发生变化。

6 低氧与lncRNAs对牙周组织的影响

通常把长度大于200个核苷酸的非编码RNA称为lncRNA，其在维持干细胞分化和多能性方面具有重要生理作用[40]。牙周炎属于低氧性疾病，而低氧与众多lncRNAs的表达存在密切联系。低氧下不同lncRNA的生物学行为不同。如针对缺血性中风的研究发现，lncRNA-GAS5、lncRNA NR_120420、lncRNA NKILA在糖氧剥夺模拟条件下表达上调，并加重细胞凋亡，其作用机制还与mi-RNAs、si-RNAs以及NF-κB信号通路密切相关[41-43]；而lncRNA ANRIL的表达在糖氧剥夺后明显降低，促进其表达可减轻糖氧剥夺所诱导的细胞损伤[44]。另外，lncRNA MALAT1可减轻糖氧剥夺/复氧诱导的脑血管内皮细胞凋亡，降低低氧/复氧诱导的人脐静脉内皮细胞功能紊乱[45-46]。研究对牙周炎患者和正常人牙周组织样本中的lncRNA进行芯片筛查，发现lncRNA-01126在牙周炎组织中特异性高表达，提示低氧与某些lncRNA的差异性改变及生理功能存在关联[47]。众多研究还表明疾病的发展和预后与lncRNAs的表达有关，而lncRNAs的表达与组织低氧联系紧密，如胃肠道肿瘤、神经系统发育和损伤、肾细胞癌等[48-50]，其潜在机制的研究仍在不断深入。

7 展 望

牙周炎作为众多低氧性疾病中的一种，牙周组织低氧环境对牙周炎的发生发展具有重要作用。一方面，低氧导致机体产生损害性应激(产生炎性因子和自由基、引起细胞自噬与凋亡、激活炎症信号通路等方式)，从而导致牙周组织破坏。另一方面，机体在低氧条件下发生适应性反应(包括牙周细胞的成骨分化以促进牙槽骨再生、缺氧耐受增强、细胞代谢相关酶活性提高以及牙周血管再生与改建等)。低氧与牙周炎有着紧密的联系，近年来关于低氧与lncRNAs的研究也逐渐引入到牙周疾病方面。本综述主要探讨牙周组织低氧环境对牙周炎发生发展的影响及相关机制，希望为牙周炎的预防和治疗提供新的思路。